食品中有害微生物的常规检验方法分析

刘立新

新疆省吐鲁番市疾病预防控制中心检验科，新疆吐鲁番838000

食品中有害微生物的常规检验方法分析

刘立新

新疆省吐鲁番市疾病预防控制中心检验科，新疆吐鲁番838000

食品安全直接关系着人民群众的身体健康和生命安全。近年来，受经济利益的驱使，食品安全事故屡见报端，食源性疾病的发生率不断升高，食品微生物指标不合格等现象也引起了人们的广泛关注，成为亟待解决的重点问题之一。聚合酶链式反应（PCR）技术是基于分子生物学技术的用于检验食品中有害微生物的常规方法之一，其特异性和敏感性高，同时兼具检测速度快、准确性高等优点，在食品有害微生物检测中发挥了重要作用。本文介绍了PCR技术检测食品有害微生物的主要流程与现状，就目前该技术应用于食品有害微生物检测中存在的问题及其解决措施进行了探讨，旨在为食品有害微生物检验提供借鉴和参考。

食品；有害微生物；PCR技术；检验方法

食品安全问题一直是社会各界关注的热点问题之一，而食品微生物检验是提高食品安全水平和控制食品质量的重要技术手段，有助于减少食品微生物污染，防止食品中的有害微生物危害食品品质和人们的身体健康[1]。近年来，因有害微生物而引发的食物中毒事故也明显增多，血清学鉴定、生长法、非选择性和选择性增菌等传统检测方法虽然准确性较高，但较费时费力，难以及时发现致病菌和有效控制污染[2]。聚合酶链式反应（PCR）技术是调查食品源疾病暴发和鉴定病原菌的有效工具，具有特异性强、灵敏度高和快速准确等优点，目前在食品检测领域的应用十分广泛。

1 PCR技术检测食品有害微生物的流程

PCR技术是一种在体外迅速扩增特定基因或DNA序列的方法，即指借助体外酶促反应作用，通过循环操作（变性-延伸-复性）不断扩充DNA模板，之后观察扩增结果以识别细菌。该技术可从食品中检出痢疾杆菌、大肠杆菌及各种毒素等食品中常见的有害微生物，具有较高特异性和敏感性，可快速准确的检出有害微生物，在食品有害微生物检验中具有其独特优势[3]。

PCR技术检测食品中有害微生物的主要流程包括引物设计、模板的制备、基因扩增和PCR产物分析。其中PCR引物直接影响着扩增的特异性，对扩增的成功与否也起着关键的作用，而对所检测对象遗传背景的了解则决定着设计的准确性。此外，PCR结果也取决于靶序列的选择，如引物设计不当，则会影响对关键靶序列的选择，导致PCR检测的特异性和灵敏度降低，甚至导致其失败。因此，引物应位于待分析基因组中的高度保守区域，长度宜确定为18～30个碱基[4]。而模板模板的纯度与目标分子数量会影响PCR检测方法的可靠性，目前，离心、固定化凝集素、阴阳离子交换树脂等分离纯化方法在食品体系中细菌浓缩方面的应用已日益广泛。在基因扩增时应选择合适的PCR参数，还可采用定量PCR、多重PCR与巢式PCR等多种衍生技术。在PCR产物分析方面，将其扩增产物行凝胶电泳和染色后，经紫外光照射可见其特异区段的DNA带，可用于鉴定不同的DNA。此外，还可通过序列测定等手段分析其序列，以确认扩增产物。

2 PCR技术检测有害微生物的应用现状

2.1 大肠杆菌

目前，应用多重PCR技术检测肠出血大肠杆菌、肠毒素大肠杆菌已有较多报道，其中前者可引起溶血性尿毒综合征、血栓形成血小板减小性紫癜等，二者并发时死亡率可达80%[5]；后者是引起腹泻的主要原因，对公共卫生有极大危害。多项研究表明应用PCR技术检测上述致病菌具有操作简便、用时短等优点，也相对更特异、灵敏和简便。

2.2 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是一种可引起食物中毒的重要细菌。据报道，由该细菌所引起的食物中毒居第二位，仅次于大肠埃希菌，在细菌性食物中毒中占33%，部分国家甚至高达45%[6]。肠毒素是导致金黄色葡萄球菌食物中毒的重要因子，近年来国外已有采用PCR技术检测肠毒素基因的报道，但有关该技术检测葡萄球菌致病因子的研究较少，多局限于对PCR技术的探讨及其扩增反应最佳条件的选择等少数领域。

2.3 沙门氏菌

沙门氏菌是一种革兰阴性肠道致病菌，对人畜均有极大危害，主要通过家禽、蛋和肉类产品传播。该致病菌在污染食品中的含量水平远低于有感染病人病灶中的含量，加之受食品加工及其本身性质的干扰，导致沙门氏菌的检测较为困难。血清学鉴定等传统检测方法虽然比较可靠，但通常需4～7 d才能完成，比较费时、费力，难以满足快速检测的需要，也就无法确保食品安全。PCR技术现已广泛用于沙门氏菌的检测，并不断得以改进和发展，应用前景较为广阔。近年来，随着实时定量PCR的产生和发展，采用该技术检测沙门氏菌的报道越来越多，成功报道也屡见不鲜。

2.4 其他致病菌

其他还有产单核李斯特菌、空肠弯曲菌和耶尔森氏菌等，其中产单核李斯特菌（Lm）多存在于蔬菜、肉类和奶酪等食品当中，以小孩、老年人和免疫缺陷个体为主要感染群体。应用PCR技术可直接从食物样品中检测，并且在肉类、牛奶及奶制品的检测上有较多成功的例子。空肠弯曲菌是从腹泻病人粪便中分离出来的一种致病菌，目前已被认为是引发人类腹泻的主要致病菌之一，其感染人体的主要媒介是接触畜禽类或食用受污染的水源、牛奶和禽制品，近年来应用PCR技术检测该致病菌已引起了人们的重视并取得了较大的进展。耶尔森氏菌也是危害人类健康的常见致病菌，为确保食品安全，对食品中假结核耶尔森氏菌与小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测十分必要，而建立一种PCR反应体系可迅速准确地在水源、水制品、奶制品和肉制品中检测出小肠结肠炎耶尔森氏菌[7]。

3 PCR应用于食品检测存在的问题及解决措施

应用PCR技术检测食品中有害微生物目前主要存在以下问题：①食物自身的成分较为复杂，导致从其原料中抽提DNA的效率较低；②在区别活菌和死菌方面存在缺陷，因此有必要进行有效的前处理；③食品基质、培养基成分及残留食物成分易对PCR酶反应造成干扰和抑制。

鉴于存在以上问题，近年来多种新型PCR技术得到了快速发展，在一定程度上克服了传统PCR技术的缺点，其中PCR与ELISA技术、荧光检测或基因探针相结合的方法较为成功，具有操作简单、结果直观可靠、特异性强、定量准确和重复性好等优点[8]。以实时荧光定量PCR法为例，该检测方法可实时监测整个PCR进程，且无需对PCR扩增产物进行后处理，有效克服了传染方法易污染的缺点。此外，有的科学工作者针对PCR检测食品中出现的假阴性结果、检测灵敏度降低等问题提出了很多切实可行的解决办法，进一步提高了该技术的实用性和应用范围[9]。

综上所述，PCR技术具有特异、敏感、快速等优点，是一种具有重要应用价值的检测手段，可及时准确的检测出食品中的有害病原微生物，随着生物技术的进一步发展，该技术也会进一步趋于完善，必将在食品检测领域发挥更重要的作用。

[1]余欣达.浅谈食品监测中微生物技术应用分析[J].中国化工贸易，2013（6）：308-309.

[2]许子刚.浅谈食品微生物检验内容与检测技术分析[J].科技与企业，2012(7)：277.

[3]许佳妮.食品有害微生物快速检验方法[J].现代农业科技，2012（14）：284-285.

[4]康晓伟.浅谈食品中微生物检测技术[J].农民致富之友，2013（5）：56.

[5]张宁.食品微生物检测技术和方法[J].品牌与标准化，2014（10）：17.

[6]杨晓楠，韩玲.食品微生物检验过程中的质量控制分析[J].甘肃农业，2013（8）：16-17.

[7]王小东，欧雁方.食品中常见有害微生物的常规检验方法分析[J].中国保健营养，2014，1（下）：574.

[8]张新武，杜小波，徐素玲，等.食品中微生物危害的分析和控制[J].食品安全治疗检测学报，2014（10）：3295-3299.

[9]王永,赵新,兰青阔,等.食品中微生物危害控制及风险评估研究[J].天津农业科学,2014,20(10):47，50.

Analysis of Conventional Test Methods of Harmful Microorganisms in Food

LIU Li-xin
Turpan Center for Disease Control and prevention in Xinjiang City Clinical Laboratory 838000 China

The food safety is directly related to people's health and life safety.In recent years,driven by economic interests,the food safety accident frequently appear in newspapers,increased incidences of food borne diseases,food microbiology indicators unqualified phenomenon has caused people's extensive concern,become one of the key problems to be solved.Polymerase chain reaction(PCR)technology is a molecular biology technique for one of the conventional method of harmful microorganisms in food based on the test,the high specificity and sensitivity,fast detection speed,simultaneously has the advantages of high accuracy,the food is harmful to play an important role in microbial detection.This paper introduces PCR technology to detect food harmful microorganism mainly process and current situation,at present the technology applied in food is harmful to the presence of microbial detection problems and solving measures were discussed,aimed to harmful microorganism inspection and provide the reference for food.

Food;harmful microorganisms;PCR technology;Test method

R15

A

1672-5654（2015）03（c）-0038-02

2015-01-11）

刘立新（1965-），女，新疆哈密人，大专，主管检验师，主要从事疾控卫生检验工作。