拟南芥用于除草剂先导化合物筛选的研究

张志刚，杨自文，王开梅，张露云

摘要：采用水琼脂表面涂布法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）的发芽率和对常用溶剂敏感性进行了试验，用几个常用靶标对2个除草剂标准样品和7个除草剂商品制剂进行了除草活性测定，同时对1 880个微生物源提取物进行了筛选试验。结果表明，拟南芥用于先导化合物筛选具有稳定、高效、操作简单和敏感性高等突出优点;使用拟南芥可有效的减少低活性样品的漏筛;拟南芥是双子叶除草剂先导化合物筛选的首选靶标之一。

关键词：拟南芥（Arabidopsis thaliana）;先导化合物;除草活性;微生物源提取物;双子叶植物。

中图分类号：S482.4         文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5731-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.026

除草剂先导化合物筛选与除草剂农药活性生物测定在靶标设定上有很大差别。除草剂先导化合物筛选对象是低含量、低活性的先导化合物。因为先导化合物在原材料中含量低、活性低，其对常规的中、低敏感度的农药生物测定靶标无明显活性甚至不显示活性，所以提高检测敏感度和增加筛选通量是先导化合物筛选成功的关键。先导化合物筛选必需使用高度敏感的靶标，以增大具有潜在农药活性的先导化合物的发现机率。拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为遗传学和植物发育研究中的模式生物之一，在农业科学中所扮演的角色正如小鼠和果蝇在人类生物学研究一样。拟南芥严格自花受粉的特点可以保证种质资源的一致性和稳定性。使用拟南芥进行除草剂先导化合物筛选，不仅极大提高筛选的敏感度，减少漏筛，而且突破了使用杂草种子在种子资源少和种子品质差异大等不利因素的限制。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  拟南芥种子  试验使用的拟南芥种子为哥伦比亚野生型，由湖北省生物农药工程研究中心养虫室提供。试验用种子保存在具透气塞的玻璃管中，保存温度为20 ℃。

1.1.2  供试靶标  狗牙根、油菜为市售种子，反枝苋种子和浮萍为武汉地区野外采集。

1.1.3  琼脂粉  北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产，型号DH010-40。

1.1.4  试剂与标准样品  用于靶标表面处理的试剂：75%酒精、2%次氯酸钠溶液。常用溶剂：丙酮、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、吐温-80，以上试剂均为市售分析纯化学试剂。除草剂标准样品：乙草胺（95%）、硝磺草酮（98%）。商品除草剂：氟吡甲禾灵、精异丙甲草胺、精喹禾灵、氯氟吡氧乙酸、水花生必杀（复配）、2甲4氯钠、2甲4氯二甲胺盐，以上样品均为市售商品除草剂。

1.1.5  放线菌和真菌发酵提取物  由湖北省生物农药工程研究中心先导化合物研究室提供。

1.2  试验方法

1.2.1  拟南芥种子表面处理及筛选用培养板制备[1]  称取1.0 g拟南芥种子置于80 mL离心管中，先用75%酒精浸泡30 s，快速移出酒精，再经2%次氯酸钠溶液浸泡10 min，再以无菌水反复振荡、浸洗5次以上，最后移除积水备用。把经过高压灭菌后的0.5%的黄原胶50 mL加入盛有1.0 g种子的80 mL离心管中，用旋转振荡器振荡3～5 min，使种子分散均匀，倒入长方形加样盒中备用。把经过高压灭菌后的0.7%的琼脂加入96孔组织培养板（深孔）[2]，每孔加入量1 mL，冷却后备用。把黄原胶与种子混合物转接到琼脂表面，接入量为20 μL/孔（接种量为30～40粒种子/孔）。

1.2.2  拟南芥种子春化处理试验[3]  成熟的拟南芥种子经历低温进行春化后才能快速同步发芽。常用的春化方法是播种后，种子与培养基一起进行4 ℃低温处理（4 d）。这种方法可以用于拟南芥的人工栽培，但不适用于生物测定。所以本试验采用干燥种子进行低温春化。干燥的种子春化处理分为5组：第1组收获后持续保存在20 ℃;第2组在4 ℃冰箱中春化处理7 d;第3组在4 ℃冰箱中春化处理14 d;第4组在4℃冰箱中春化处理21 d;第5组为在4℃冰箱中春化处理28 d。按1.2.1中的方法把经过不同时间春化处理的种子接入96孔组织培养板中的琼脂上，加盖培养。培养条件为：温度18 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度8 000 lx。每组使用2个组织培养板，重复3次。培养4 d后检查种子发芽情况，记录发芽率。

1.2.3  常用溶剂对拟南芥种子发芽的影响试验  把丙酮、乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇分别制备成10%的母液。在组织培养板中加入不同量的各溶剂母液。按1.2.1的方法接入拟南芥种子。每个浓度设2组，每组重复3次，5 d后以目测法确定拟南芥生长是否受影响。第1组：接入种子后的组织培养板在无菌操作台上静置4 h后，加盖培养;第2组：接入种子的组织培养板直接加盖后移入人工气候室培养。培养条件为：温度18 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度8 000 lx。

1.2.4  除草剂筛选靶标对除草剂标准样品及商品制剂的敏感性比较[3]  活性评价指标：根据活性反应的不同，使用分级指标数（0、3、5、7、9）标记除草活性[4]。除草剂对常规筛选靶标的敏感性试验：将样品配制成母液，浓度为1.00 mg/mL，以含0.1% 吐温-80的无菌水稀释成12个不同的浓度梯度。各组织培养板中琼脂表面涂布样品溶液量为0.02 mL/孔，按1.2.1的方法接入拟南芥种子。每个浓度设2个重复，重复试验3次。培养条件为：温度18 ℃，相对湿度70%～80%，每天光照9 h，光照强度8 000 lx。7 d后检查并记录结果，计算LC50。