酿酒工艺对黄酒中生物胺的影响

俞剑燊，张凤杰，王德良，李红，胡健，彭金龙

（1.上海金枫酒业股份有限公司，上海201501；2.上海石库门酿酒有限公司，上海201501；3.中国食品发酵工业研究院，北京100027）

酿酒工艺对黄酒中生物胺的影响

俞剑燊1，2，张凤杰3，王德良3，李红3，胡健1，2，彭金龙1，2

（1.上海金枫酒业股份有限公司，上海201501；2.上海石库门酿酒有限公司，上海201501；3.中国食品发酵工业研究院，北京100027）

采用高效液相色谱技术，针对黄酒酿造工艺，模拟实际生产，分析了微生物、工艺参数和冷热处理等对黄酒中生物胺含量的影响。结果表明，酵母Y可使生物胺总量降低，霉菌M可使生物胺总量增加，细菌除戊糖片球菌L04使生物胺总量降低外，其他细菌均可使生物胺总量增加；在培养温度32℃，培养时间3 d，pH值为3.5，酒精体积分数15%的条件下，生物胺总量为60.19 mg/L；煎酒使生物胺含量增加，冷冻过滤技术因有效降低酪胺含量使生物胺总量大幅降低。

黄酒；生物胺；微生物；工艺；冷热处理

黄酒是我国历史上最古老的酒种之一，其发酵方式为传统的开放式，且多菌种参与酿造过程，这使黄酒营养丰富，但同时也会存在微量的有害物质（如生物胺）。生物胺是一类含氮低分子质量有机化合物（如色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺等）。生物胺是生物机体内的正常活性成分，发挥重要的生理作用[1]，但积累到一定浓度时，会引起不良反应（如头痛、呼吸紊乱、心悸等[2-3]）。

目前，研究者已经对黄酒中生物胺的检测方法做了大量研究[4-8]，也有研究者对黄酒发酵液中产生物胺乳酸菌进行了分离鉴定与评价[9]。张凤杰等[10]对黄酒生产过程中生物胺含量的变化进行了跟踪分析，认为黄酒中生物胺主要来自发酵过程，并推测丰富的氨基酸不是限制发酵过程中生物胺形成的因素，而产生物胺的复杂菌群随基质条件的变化而相应变化是生物胺形成的关键。

因此，本实验采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）研究黄酒酿造工艺对黄酒中生物胺的影响，主要为微生物、不同培养基质、温度、pH值、溶解氧、时间、酒精度及酒体冷热处理等对生物胺变化的影响，为控制和降低黄酒中生物胺含量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒发酵液：上海金枫酒业股份有限公司；酵母Y、霉菌M：均从上海金枫酒业股份有限公司提供的黄酒发酵醪液中分离所得；细菌：中国食品发酵工业研究院实验室保藏[11]。

化学试剂：8种单体生物胺标样（色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）、18种氨基酸标样、1,7二氨基庚烷（内标）、丹磺酰氯（衍生剂）：美国Sigma公司产品；异硫氰酸苯酯、三乙胺，三氯甲烷、正丁醇、正己烷、三氯乙酸、丙酮、甲醇、乙腈（色谱纯）：国药集团药业股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Perkin Elmer Series 200高效液相色谱仪（配紫外检测器）：美国Waters公司；UV-2401 PC分光光度计：尤尼克（上海）仪器有限公司；LRH-250生化培养箱：上海恒科仪器有限公司；DC-12氮吹仪、0.45 μm针头微孔滤膜过滤器：上海安谱科学仪器有限公司；KQ520超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；L80-2离心沉淀机：上海跃进医疗器械厂；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；XW-80A旋涡混合器：上海青浦沪西仪器厂；LDZX-50KBS立式电压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DKZ系列电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；BS210S分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面超净工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理方法

黄酒发酵液：从黄酒酿造车间取样，两层纱布灭菌后，滤纸过滤，121℃灭菌15 min保存。

1.3.2 生物胺测定方法

参照GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的测定》[12]。

1.3.3 酒精度、总酸、总糖、pH值测定

参照GB/T 13662—2008《黄酒》[13]。

1.3.4 微生物在酿造过程对生物胺含量影响的测定方法

取不同时间的黄酒发酵醪，按照1.3.1所述方法处理后，接种从黄酒发酵醪液中分离出来的经过活化的菌株（酵母Y和霉菌M及10种细菌，接种量为0.5%），30℃培养5 d，测定培养液中生物胺含量的变化，并选出使黄酒发酵醪中生物胺降低最多的菌株。

1.3.5 酿造工艺参数对生物胺含量影响的测定方法

选取上述黄酒发酵醪中生物胺降低最多的菌株为试验菌株，以生物胺总量含量为指标，按照4因素3水平进行正交试验，测定不同基质、温度、氧气和时间对生物胺含量的影响。

1.3.6 冷热处理对黄酒中生物胺含量影响的测定方法

采用煎酒、低温长时间贮存和冷冻3种方式来处理黄酒，通过测定处理前后黄酒中的生物胺含量，分析这3种处理方式对黄酒中生物胺含量变化的影响。

2 结果与分析

2.1 微生物在酿造过程对生物胺含量的影响

酵母、霉菌和细菌共同参与了黄酒酿造过程。栾同青等[14-15]研究提出黄酒中有些乳酸菌会产生生物胺，最新研究表明，有些植物乳杆菌会产生胺氧化酶，分解生物胺，研究者利用此特性来降低葡萄酒中的生物胺[16]。目前，并没有黄酒酿造酵母和霉菌对生物胺影响的报道，葡萄酒酿造酵母是否产生生物胺也存在一定争议[17-18]。为模拟工业化黄酒酿造，研究黄酒中的这些微生物最终对生物胺含量产生怎样的影响，从黄酒酿造车间，按照1.3.4中所述方法测定培养液中生物胺含量接种酵母Y、霉菌M、细菌前后变化，结果见表1～表3。

表1和表2结果表明，酵母Y在第2天发酵醪和第4天发酵醪中培养后组胺有明显降低（P＜0.05），其他胺变化不明显；霉菌M在第2天发酵醪和第4天发酵醪中培养后酪胺有明显增多（P＜0.05），尸胺有少量增加，腐胺有少量降低，其他胺变化不明显；从生物胺总量上来看，酵母降低了生物胺总量，但霉菌使生物胺含量增加，且在第2天发酵醪中增加量最大，这是因为第2天发酵醪中霉菌更容易生长。综上分析，酵母Y不会带来生物胺安全性问题，但霉菌M使发酵醪液中酪胺含量升高。

表3结果表明，多数细菌使发酵醪液中生物胺含量增加，只有戊糖片球菌L04因分解酪胺而使生物胺总量明显降低；短乳杆菌L11使生物胺含量增加最多，其次是菌株L19和L21，这三株菌同为短乳杆菌且表现为酪胺的显著增加（P＜0.05）；分解组胺的菌有片球菌L04、L38，短乳杆菌L11、L19和干酪乳杆菌L45；不同菌株培养液中总酸含量差异显著，这与菌株在发酵液中生长繁殖及其本身的产酸能力有关，片球菌、棒状乳杆菌和芽孢杆菌的酸度变化不明显。

2.2 酿造工艺参数对生物胺总量的影响

选择第4天发酵醪为培养液，酵母Y及戊糖片球菌L04为试验菌株，大瓶、不密封、早晚摇匀的溶氧方式，以生物胺总量为指标，进行4因素3水平正交试验，结果和分析见表4。

由表4可知，影响生物胺总量顺序的因素依次为B＞A＞C＞D，对于黄酒酿造来说，生物胺总量越低越好，故最佳条件为A3B1C1D3，在此条件下，做验证试验得出生物胺总量为60.19 mg/L。

2.3 冷热处理对黄酒生物胺含量的影响

黄酒本身是一个成分复杂的不稳定胶体，不同的酒样有其稳定的pH值和等电点，打破胶体的平衡，某些成分会析出以达到新的平衡。这是黄酒中非生物浑浊产生的原因，浑浊包括冷浑浊、氧化浑浊和热浑浊，通常采用煎酒、低温长时间贮存和冷冻处理来澄清黄酒[22-23]。因此通过试验分析这三种处理方式对生物胺含量的影响。

煎酒前后生物胺含量变化见图1，由图1可知，高温处理使生物胺含量增加，增加最多的为酪胺、其次为腐胺。这与栾同青[14]提出的“贮存温度越高，生物胺增幅越大”类似，也可能与高温蒸发有关。

不同年份坛装黄酒上部清酒和酒脚中生物胺的差异见图2。酒脚部分酪胺较上部清酒少，色胺、组胺、尸胺和腐胺在酒脚部分却略高于上部清酒，从生物胺总量来看，坛装黄酒上下部分没有规律性差异。由图2可知，酒脚部分酪胺较上部清酒少，色胺、组胺、尸胺和腐胺在酒脚部分却略高于上部清酒，从生物胺总量来看，坛装黄酒上下部分没有规律性差异。

三批酒样置于-2～0℃冻放4 d，其生物胺含量变化见图3。冷冻过滤之后，生物胺总量降低，特别是酒样2，生物胺降低50.82 mg/L，主要表现为酪胺的减少，但腐胺有少量增加，其他胺变化无规律。

由此看来，煎酒、自然沉淀、冷冻处理对每种生物胺的影响并没有明显规律性，这可能与不同酒体中各种生物胺的含量不同，从而使胶体状态不同有关。但煎酒使生物胺含量增加，冷冻过滤技术因有效降低酪胺含量使生物胺总量大幅降低。

3 结论

采用HPLC技术分析了酵母、霉菌和细菌对黄酒生产过程中生物胺含量变化的影响；通过正交试验探究了酿造参数对生物胺含量变化的影响；同时，分析了煎酒、自然沉淀、冷冻过滤三种工艺对生物胺含量的影响。

综合分析，黄酒中的生物胺主要来自微生物代谢，特别是部分细菌，如短乳杆菌。酿酒工艺（如不同基质）因影响这些微生物的生长和代谢而影响生物胺含量。另外，试验发现有些乳酸菌不产生物胺，甚至能分解部分生物胺。在不影响黄酒口味和营养的前提下，如何通过调整酿造工艺，使这部分优势菌株发挥其优良的酿造特性，并抑制其他菌株的代谢，可以控制和降低黄酒生物胺。黄酒的机械化和现代化酿造是行业发展的方向，利用生物胺安全性好且发酵性能优良的菌株或菌系组合可以从根本上控制生物胺。谢广发等[24]的研究已经证明了将植物乳杆菌应用于浸米过程，可降低浸米水中的生物胺。

酿造参数对总生物胺的影响试验表明，在培养温度32℃，培养时间3 d，pH值为3.5，酒精体积分数15%的条件下，生物胺总量为60.19 mg/L

温度对黄酒生物胺的影响表现为发酵温度和贮存温度[14]越高越利用生物胺的积累；高温煎酒使生物胺含量增加；低温冷冻使生物胺含量大幅降低。由此可见，如何控制好温度，不仅是黄酒酒体质量的关键，也是控制和降低生物胺的重要措施之一。

[1]AP N K,LI O,KOBAWILA S C,et al.Response mechanisms of lactic acid bacteria to alkaline environments:a review[J].Crit Rev Microbiol, 2012,38(3):185-190.

[2]PANCONESI A.Alcohol and migraine:trigger factor,consumption, mechanisms.a review[J].J Headache Pain,2008,9(1):19-27.

[3]FERREIRA I M,PINHO O.Biogenic amines in Portuguese traditional foods and wines[J].J Food Prot,2006,69(9):2293-2303.

[4]ZHONG J J,YE X Q,FANG Z X,et al.Determination of biogenic amines in semi-dry and semi-sweet Chinese rice wines from the Shaoxing region[J].Food Control,2012,28(1):151-156.

[5]HUANG K J,WEI C Y,LIU W L,et al.Ultrasound-assisted dispersive liquid-liquid microextraction combined with high-performance liquid chromatography-fluorescencedetectionforsensitivedeterminationofbiogenic amines in rice wine samples[J].J Chromatogr A,2009,1216(38): 6636-6641.

[6]陆永梅，董明盛，吕欣，等.高效液相色谱法测定黄酒中生物胺的含量[J].食品科学，2006，27（1）：196-199.

[7]彭祺，边威，王芳，等.液质联用法测定黄酒中生物胺含量[J].酿酒科技，2014（2）：79-82.

[8]华永有，周芬霞，林宏琳，等.HPLC-FLD法检测黄酒中9种生物胺[J].中国卫生检验杂志，2014，24（6）：761-764.

[9]周韩玲，杜丽平，孟镇，等.黄酒发酵液中产生物胺乳酸菌的分离鉴定与评价[J].食品与发酵工业，2011，37（8）：47-50.

[10]张凤杰，薛洁，王异静，等.黄酒中生物胺的形成及其影响因素[J].食品与发酵业，2013，39（2）：62-68.

[11]张凤杰，褚小米，薛洁，等.黄酒酿造过程中细菌群落组成及发酵特性研究[J].酿酒科技，2013（12）：32-35.

[12]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009. 208—2008食品中生物胺含量的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[13]中华人民共和国质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 13662—2008黄酒[S].北京：中国标准出版社，2008.

[14]栾同青.黄酒酿造过程生物胺变化规律及其产生菌株研究[D].济南：齐鲁工业大学硕士论文，2013.

[15]LÓPEZ R,TENORIO C,GUTIÉRREZ A R,et al.Elaboration of Tempranillo wines at two different pHs.Influence on biogenic amine contents[J].Food Control,2012,108(25):583-590.

[16]CAPOZZI V,RUSSO P,LADERO V,et al.Biogenic amines degradation byLactobacillus plantarum:toward a potential application in wine [J].Front Microbiol,2012,2(3):122.

[17]BOVER-CID S,SCHOPPEN S,IZQUIERDO-PULIDO M,et al.Relationship between biogenic amine contents and the size of dry fermented sausages[J].Meat Sci,1999,51(4):305-311.

[18]LANDETE J M,FERRER S,PARDO I.Biogenic amine production by lactic acid bacteria,acetic bacteria and yeast isolated from wine[J].Food Control,2007,18(12):1569-1574.

[19]MARQUES A P,LEITÃO M C,SAN ROMÃO M V.Biogenic amines in wines:Influence of oenological factors[J].Food Chem,2008,107(2): 853-860.

[20]于英，李记明，姜文广，等.酿酒工艺对葡萄酒中生物胺的影响[J].食品与发酵工业，2011，37（11）：66-70.

[21]张敬，赵树欣，薛洁，等.葡萄酒中生物胺含量的影响因素研究[J].中国酿造，2012，31（10）：18-21.

[22]谢广发.黄酒酿造技术[M].北京：中国轻工出版社，2010.

[23]高恩丽，帅桂兰，赵光鳌，等.微滤及冷冻技术在黄酒生产中的应用[J].无锡轻工大学学报，2001，20（4）：338-390.

[24]谢广发，曹钰，程斐，等.应用生物酸化浸米技术生产黄酒[J].食品与生物技术学报，2014，33（2）：217-223.

YU Jianshen1,2,ZHANG Fengjie3,WANG Deliang3,LI Hong3,HU Jian1,2,PENG Jinlong1,2
(1.Shanghai Jinfeng Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China; 2.Shanghai Shikumen Wine Co.,Ltd.,Shanghai 201501,China; 3.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

In view of the Chinese rice wine brewing process,simulating the actual production,the effects of microorganism,technological parameters and cold-heat treatment on the biogenic amine content in Chinese rice wine were analyzed.The results showed that yeast Y can decrease the total biogenic amines content,while mould M can increase the total biogenic amines content.As to bacteria,in addition toPediococcus pentosaceus L04 reduced the total biogenic amines content,other bacteria all increased the total biogenic amines content.Under the condition of temperature 32℃,time 3 d,pH 3.5 and alcohol concentration 15%,the biogenic amine content was 60.19 mg/L.Wine boiling increased the content of biogenic amines,and freezing filtration technology greatly reduced the total biogenic amine by effectively reducing tyramine content.

rice wine;biogenic amine;microbes;process;cold-heat processing

TS261.4

A

0254-5071（2015）04-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.028

2015-03-02

国家科技支撑计划（2012BAK17B11）

俞剑燊（1974-），男，高级工程师，硕士，研究方向为发酵工艺与工程。