微波和高温灭菌对神仙豆活性成分及其抗氧化性的影响

刘 玮，叶 川，林 琳，姜绍通，陆剑锋

（合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥230009）

微波和高温灭菌对神仙豆活性成分及其抗氧化性的影响

刘 玮，叶 川，林 琳，姜绍通，陆剑锋*

（合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥230009）

为研究微波和高温灭菌对神仙豆品质的潜在影响，分析了处理前后神仙豆主要活性成分和抗氧化性的变化。结果表明，除总糖和粗纤维含量变化均不显著外(P＞0.05)，两种灭菌方式均导致神仙豆活性成分含量的不同程度降低；高温灭菌后，神仙豆氨基酸态氮降低9.52%(P＜0.05)，蛋白质降低14.96%(P＜0.05)，还原糖降低33.75%(P＜0.05)，类黑精降低61.29%(P＜0.05)，异黄酮降低5.00% (P＞0.05)；微波灭菌后，神仙豆氨基酸态氮降低19.05%(P＜0.05)，蛋白质降低1.11%(P＞0.05)，还原糖降低28.75%(P＜0.05)，类黑精降低70.97%(P＜0.05)，异黄酮降低20.00%(P＜0.05)；在抗氧化性方面，除对·OH的清除活性外，微波灭菌处理的神仙豆抗氧化性均相对高于高温灭菌组。综合来说，微波灭菌处理的神仙豆抗氧化性相对较高。

神仙豆；活性成分；高温；微波；抗氧化

豆豉是一种传统调味副食品，在我国有着悠久的历史，其豉香诱人、营养丰富、风味独特，深受消费者欢迎[1]。豆豉不仅营养丰富，而且含有许多具有生理功能的活性物质，具有预防糖尿病、抗氧化、降血压、溶血栓等作用[2]。豆豉的抗氧化成分按其来源大致分为两类：一类是大豆中本身具有的天然抗氧化成分（如酚酸类、维生素C、类黑精、异黄酮等化合物）；另一类是加工过程中利用微生物及其酶的综合作用所形成的抗氧化物质[3]。神仙豆是淮南地区民间的一种特色自然发酵豆制品，经精选、浸泡、蒸煮、发酵、成熟、炒制等传统工艺制备得到[4]。与纳豆（Natto）相似，神仙豆属于细菌型豆豉制品[6]，主要利用枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）繁殖于蒸熟的大豆上，借助其蛋白酶产出独特的风味[5]。

已有的研究表明，在大豆发酵过程中，大分子有机物在微生物及酶的作用下进行分解和重组，同时经过复杂的生化作用形成代谢产物和变性物质（如蛋白质分解为多肽和氨基酸、异黄酮糖苷转化为生理活性较高的苷元，以及美拉德反应生成类黑精等），这些成分均有助于增强豆豉的抗氧化性[7-8]。但在食品加工后期，采用不同的灭菌处理方式可能会直接影响或改变食品的物理和化学性质（如蛋白质、维生素、芳香物质等热敏性营养素的降解及损失）[9]。与新鲜样品相比，经微波加热后的食品，其酚酸类和黄酮类物质的含量可能出现下降，如ZHANG M等[10]将鞑靼荞麦提取物置于700W功率的微波炉中加热10min，其类黄酮多酚物质显著减少。同时，微波可能会影响食品的抗氧化活性，如CHUAH A M等[11]将青椒、红辣椒、青椒粉、红椒粉等置于500 W功率微波炉中加热5 min，发现样品清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力降低；ZHANG D等[12]将花椰菜的花及茎于600 W微波中分别加热30 s、60 s、90 s、120 s、300 s，发现样品总抗氧化活性和酚类物质的抗氧化活性均逐渐减小。此外，高温灭菌对豆类食品的活性物质和抗氧化性也有不同程度的影响。如XU B等[13]研究了高温处理对黄豆和黑豆总酚、酚酸、异黄酮、花青素及其抗氧化性的影响，发现水煮和蒸煮均导致两种豆子活性成分和抗氧化性不同程度降低；ARCAN I等[14]研究了不同热处理条件对鹰嘴豆和白豆蛋白水提物抗氧化性的影响，发现经121℃、20 min灭菌后，鹰嘴豆的Fe2+螯合能力提升了1.8倍，而白豆的Fe2+螯合能力却降低了2.3倍。

豆豉的活性成分包括氨基酸态氮、蛋白质、还原糖、类黑精、异黄酮等多项指标。为研究不同灭菌处理对神仙豆品质的潜在影响，采用微波和高温两种方式，分析了处理前后神仙豆活性成分的变化。并以维生素C为阳性对照，选取羟自由基（·OH）清除活性、DPPH自由基清除活性、Fe3+还原能力和亚油酸自氧化抑制能力等指标测定灭菌前后的神仙豆抗氧化性。本研究可为神仙豆选择合理的杀菌方式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

神仙豆制品：安徽淮南市焦岗湖忠辉食品有限公司，灭菌处理后的样品在4℃保藏直至使用。

主要试剂：抗坏血酸（VC），水杨酸、乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、DPPH、铁氰化钾、三氟乙酸、硫酸亚铁、亚油酸、硫氰酸铵等均为分析纯：合肥美丰化工仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

Hanon K9840自动凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海大普仪器有限公司；HH-2数显水浴锅：江苏金坛市环宇科学仪器厂；DT5-4低速离心机：北京时代北利离心机有限公司；SA8自动旋涡振荡混合器：英国STUART公司；722E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；90-3定时恒温磁力搅拌器：上海沪西分析仪器有限公司；FD-1B-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

豆豉原料采用传统工艺发酵制备，发酵成熟后进行加料炒制，最后真空包装，并进行灭菌处理（高温灭菌：压力0.10～0.15 MPa，温度100℃，时间10 min；微波灭菌：功率1 300 W，时间90 s[15]）。采用未灭菌的作对照，用研钵研磨成粉末后进行真空冷冻干燥，并粉碎过60目筛，最后放入4℃冰箱备用。

1.3.2 类黑精含量的测定[16]

取5 g样品，用体积分数10%的乙醇定容至200 mL，充分振荡，室温静置24 h，滤纸过滤，4℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液用可见光分光光度计在波长470 nm处比色。类黑精含量按如下公式计算：

式中：C为类黑精含量，%；As为样液吸光度值；V为定容体积，mL；M为样品质量，g；0.269为1 mL水溶液含0.1 mg酱油类黑精的吸光度值。

1.3.3 异黄酮含量的测定[17]

取0.1 g样品，加入体积分数80%的乙醇，液料比为20∶1（mL∶g），在50℃提取1 h后离心，倒出浸提液，再用相同体积的溶剂浸提滤饼，合并两次浸提液，用紫外分光光度计在波长260 nm处测定吸光度值。

绘制标准曲线：称取金雀异黄素标准品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，以80%乙醇溶解并定容，摇匀。精确吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL金雀异黄素标准品溶液于10mL容量瓶中，用体积分数80%的乙醇定容至刻度，摇匀。以体积分数80%的乙醇作为空白对照，在波长260 nm处用紫外分光光度计测吸光度值，以测得的吸光度值（Y）与金雀异黄素标准品量（x）得出线性回归方程：Y=0.1217x+0.008 8，R2=0.998 9，由此计算异黄酮含量。金雀异黄素标准曲线见图1。

1.3.4 其他理化成分的测定

蛋白质含量的测定采用国标GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；氨基酸态氮含量的测定采用国标GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中甲醛值法；还原糖含量的测定采用国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》的直接滴定法；总糖含量的测定采用国标GB/T15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》中的苯酚比色法；粗纤维含量的测定采用国标GB5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》中的重量法。

1.3.5羟自由基清除活性的测定

参考王艳梅等[18]的方法并作修改。采用Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基，加入水杨酸到该体系中捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质在波长510 nm处有最大吸收峰。将样品中加入无菌蒸馏水配制成一定的质量浓度，加入一定质量浓度样品4 mL，9 mmol/LFeSO40.5 mL，9 mmol/L水杨酸0.5 mL，8.8 mmol/L H2O20.5 mL，混匀，37℃水浴中加热30 min，于波长510 nm处用可见光分光光度计测定样品吸光度值，将体系中的样品改为加入4 mL蒸馏水，测定得空白对照吸光度值，向体系中加入0.5 mL蒸馏水代替8.8mmol/LH2O2时，测定得样品本底吸光度值，以维生素C作阳性对照，用以下公式计算清除率：

式中：A1表示样品本底吸光度值；A2表示空白对照吸光度值；A0表示样品吸光度值。

1.3.6 DPPH自由基清除活性的测定

参考高义霞等[19]的方法并作修改。将样品加入无菌蒸馏水配制成一定的质量浓度，取2mL样品液和2mL1×10-4mol/L DPPH溶液（用体积分数95%的乙醇配制）加入同一具加塞试管中摇匀，室温条件下密闭放置30 min，在波长517 nm处测定吸光度值，以2 mL体积分数95%的乙醇加入2 mL蒸馏水混匀的溶液为参比。DPPH自由基清除率的计算公式：

式中：A1表示样品液＋DPPH溶液的吸光度值；A2表示样品液＋体积分数95%乙醇溶液的吸光度值；A0表示DPPH溶液＋蒸馏水的吸光度值。

1.3.7 还原能力的测定

参考荣建华等[20]的方法并作修改。将样品粉末加入无菌蒸馏水配制成一定的质量浓度，取2mL样品液加入2.5mL pH值为6.6的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L）和2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20 min后加入2.5 mL10%的三氟乙酸，混合后以3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，测定其在波长700 nm处的吸光度值。吸光度值越大，则还原能力越强。

1.3.8 亚油酸自氧化抑制能力的测定

参考WU H C等[21]的方法并作修改。将0.5 mL不同质量浓度的样品溶液、4.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液和2.0 mL亚油酸乳化液（2.5 mL亚油酸加入100 mL体积分数95%乙醇中）加入试管中加塞摇匀，于60℃避光反应24h。取50 μL反应液，依次分别加入4.0 mL体积分数75%的乙醇，50μL30%的硫氰酸铵溶液及50μL20mmol/LFeCl2溶液（以3.5%HCl配成），振荡混匀，3 min后在波长500 nm处测定吸光度值。吸光度值越小，则样品抑制亚油酸自氧化能力越强。

1.4 数据处理与分析

所有数据结果均为3次重复试验平均值，以平均值±标准差表示，并用Excel进行数据分析和作图，用SPSS 19对活性成分的变化进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 灭菌处理后神仙豆主要活性成分的变化

神仙豆的主要活性成分及含量见表1。由表1可知，神仙豆经微波和高温灭菌处理后，除总糖和粗纤维含量变化不显著外（P＞0.05），其主要活性成分含量均呈现不同程度的下降。但相比之下，高温灭菌对神仙豆氨基酸态氮、类黑精和异黄酮等指标的下降幅度影响较小，而微波灭菌对神仙豆蛋白质和还原糖的下降幅度影响较小。高温灭菌后，神仙豆异黄酮减少5.00%（P＞0.05），类黑精降低61.29%（P＜0.05），还原糖降低33.75%（P＜0.05），氨基酸态氮降低9.52%（P＜0.05），蛋白质降低14.96%（P＜0.05）；微波灭菌后，神仙豆异黄酮降低20.00%（P＜0.05），类黑精降低70.97%（P＜0.05），还原糖降低28.75%（P＜0.05），氨基酸态氮降低19.05%（P＜0.05），蛋白质降低1.11%（P＞0.05）。由此可见，采用两种灭菌处理均将导致神仙豆的活性成分含量降低，但大豆异黄酮受高温灭菌的破坏程度低于微波灭菌，这可能是由于大豆异黄酮的热稳定性相对较高的缘故[22]。然而，虽然高温灭菌对异黄酮的破坏程度低，但高温处理会促使蛋白质或多肽形成二硫键，加剧蛋白质或多肽的凝集和沉淀[23]，而且也会直接导致蛋白质或多肽显著降解（P＜0.05），最终造成神仙豆总蛋白或多肽活性显著降低。

2.2 灭菌处理后神仙豆的抗氧化性变化

2.2.1 对羟自由基的清除活性的影响

羟自由基（·OH）是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，·OH也是已知的最强的一种氧化剂，几乎可以和所有的生物大分子发生不同类型的反应，氧化效率高，反应速度快，能够引起膜脂、蛋白质和核酸的氧化损伤，导致细胞衰老、死亡和机体病变[24]。各种处理条件下的神仙豆和VC对羟自由基的清除活性见图2。由图2可知，当样品质量浓度＞1.0 mg/mL时，对·OH的清除效果为VC组＞未灭菌组＞高温灭菌组＞微波灭菌组，且样品对·OH的清除能力与质量浓度均呈现出明显的量效关系，但显著性分析的结果表明，未灭菌、高温灭菌和微波灭菌组之间对·OH的清除效果均无显著差异（P＞0.05）。

2.2.2 对DPPH自由基的清除活性的影响

DPPH自由基是一种很稳定的自由基，DPPH-乙醇溶液呈深紫色，在波长517nm处有最大吸收峰[18]。抗氧化剂存在时与DPPH的孤对电子进行配对，溶液的紫色减弱，吸光度值也随之减小，且吸光度值减小的程度与配对电子数呈剂量关系，可借此来评价物质的抗氧化活性[25]。各种处理条件下的神仙豆和VC对DPPH自由基的清除活性见图3。由图3可知，对DPPH呈现的清除活性为VC＞微波灭菌组＞高温灭菌组＞未灭菌组。显著性分析的结果表明，微波灭菌组对DPPH的清除活性显著高于高温灭菌组和未灭菌组（P＜0.05），但高温灭菌组和未灭菌组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.2.3 对Fe3+还原力的影响

抗氧化剂的抗氧化能力与其还原能力呈正相关关系，还原能力越强，相应的抗氧化能力也越强。抗氧化剂能够在一定的条件下将Fe3+还原为Fe2+，可以根据Fe3+还原为Fe2+的多少来间接评价各种提取物的抗氧化能力[26]。本实验中，还原能力大小通过波长700nm处吸光度值的大小表示。各种处理条件下的神仙豆和VC对Fe3+还原能力的影响见图4。由图4可知，样品的还原能力与其质量浓度呈一定的量效关系，随着样品质量浓度的增加，吸光度值呈上升趋势，样品的吸光度值越大，表明还原能力愈强，抗氧化效果愈佳。因此，对Fe3+还原力为VC＞未灭菌组＞微波灭菌＞高温灭菌。显著性分析的结果表明，未灭菌组对Fe3+还原力显著高于微波灭菌组和高温灭菌组（P＜0.05）。

2.2.4 对亚油酸自氧化的抑制能力的影响

由于亚油酸分子中含有2个双键，极易被氧化产生一系列的过氧化脂质，亚油酸体系的自氧化反应常被用来测定样品的抗氧化活性[18]。各种处理条件下的神仙豆和VC对亚油酸自氧化反应的影响见图5，吸光度值越小，则样品抑制亚油酸自氧化能力越强。由图5可知，随着样品质量浓度的增大，VC和神仙豆的吸光度值均呈下降趋势，表明VC和神仙豆对亚油酸自氧化的抑制作用与质量浓度呈现出明显的量效关系。在样品质量浓度为0.25～2 mg/mL时，样品吸光度值下降趋势均显著；而质量浓度为2～10mg/mL时，吸光度值下降平缓，其中高温灭菌组2 mg/mL以后吸光度值基本不变。在高质量浓度区间（5～10 mg/mL），对亚油酸自氧化的抑制能力为VC＞未灭菌组＞微波灭菌组＞高温灭菌组。但显著性分析的结果表明，未灭菌、高温灭菌和微波灭菌组之间对亚油酸自氧化的抑制能力均无显著性的差异（P＞0.05）。

2.2.5 对抗氧化性变化的总体分析

除对DPPH自由基的清除活性外，相比于高温和微波灭菌处理，未灭菌组神仙豆的抗氧化性相对较高；此外，除对·OH的清除活性外，微波灭菌处理的神仙豆抗氧化性均高于高温灭菌组。已有的研究表明，某些食品加工过程（包括工业加工和家庭烹饪）可能会导致其抗氧化性的严重损失，导致这种现象的原因之一可能是许多活性物质具有相对不稳定性[27]。而豆豉在热处理过程中将发生美拉德反应，消耗部分抗坏血酸和多酚类物质，同样也会造成抗氧化性的降低[28]。大豆蛋白肽通常具有较高的抗氧化性，推测这可能是本试验中高温灭菌处理对神仙豆抗氧化性降低的影响明显高于微波灭菌处理的主要原因。而这一推测结论也与高温灭菌处理后神仙豆主要活性成分的变化基本一致（如蛋白显著下降）。

3 结论

神仙豆经高温和微波两种灭菌方式处理后，除总糖和粗纤维含量变化不显著外（P＞0.05），其主要活性成分均呈现不同程度的下降。

对抗氧化性的测定结果表明，对照组VC的抗氧化性最高，灭菌处理方式不同对神仙豆的抗氧化性影响较大。微波灭菌处理组在DPPH自由基清除率和Fe3+还原能力方面显著高于高温灭菌处理组（P＜0.05），但对亚油酸自氧化抑制能力的差异不显著（P＞0.05）；高温灭菌处理组仅在羟自由基清除活性上高于微波灭菌处理组，但差异不显著（P＞0.05）。因此，微波灭菌处理的神仙豆抗氧化性总体优于高温灭菌处理组。

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Effect of high temperature and microwave sterilization on the bioactive components and antioxidant activities ofShenxianbeans

LIU Wei,YE Chuan,LIN Lin,JIANG Shaotong,LU Jianfeng*
(College of Biotechnology＆Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

In order to investigate the potential effect of high temperature and microwave treatment on the quality ofShenxianbeans,the changes of main bioactive compounds and antioxidant indexes were analyzed.The results showed that,two sterilizing methods both led to the decrease of bioactive compounds contents in different extent,aside from total sugar and crude fiber which showed no significant differences(P＞0.05).After high temperature sterilization,the contents of amino nitrogen,protein,reducing sugar,melanoidins,and isoflavone were decreased by 9.52%(P＜0.05), 14.96%(P＜0.05),33.75%(P＜0.05),61.29%(P＜0.05),and 5.00%(P＞0.05),respectively.While those treated by microwave were decreased by 19.05%(P＜0.05),1.11%(P＞0.05),28.75%(P＜0.05),70.97%(P＜0.05),and 20.00%(P＜0.05),respectively.Compared to those treated by high temperature,the antioxidant activities ofShenxianbeans treated by microwave were relatively better except for scavenging abilities on hydroxyl radical.To sum up,Shenxianbeans sterilized by microwave showed a relatively higher antioxidant effect.

Shengxianbeans;bioactive components;high temperature;microwave;antioxidant

TS214.2

A

0254-5071（2015）06-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.012

2015-05-09

国家星火计划项目（2012GA710082）；淮南市科技计划项目（2010A0100304）

刘玮（1989-），男，硕士研究生，研究方向为农（水）产品加工及贮藏。

*通讯作者：陆剑锋（1976-），男，教授，博士，研究方向为农（水）产品加工及贮藏。