精子功能检测在男性不育诊治中的应用

马国燕 卢 静 景 丽

河北省邯郸市中心医院生殖医学科（056001）

在临床实践中，对男性生育功能的评估主要依靠精液分析，然而常规精液分析只检测精子浓度、活力及形态学等参数，仅反映精子的质量，而只有精子的功能才能反映精子的授精能力。正常授精精子要经历获能、顶体反应、与透明带结合及穿透等一系列过程［1］。精子功能试验可检测精子执行这些功能的情况，包括精子膜完整性、顶体反应、精子核成熟度和DNA完整性、活性氧（ROS）、精子与透明带相互作用、精子-宫颈黏液相互作用检测等［2］，本文主要概述近年来常用的精子功能检测方法及研究进展。

1 精子膜完整性检测

精子膜完整性与精子运动、获能、顶体反应、精卵融合等均密切相关，对男性不育的诊治具有重要意义［3］。对于无精子症的患者实施睾丸取精并行卵细胞质内单精子注射（ICSI）时，由于睾丸精子无运动能力，需在ICSI操作前鉴别其活力，因此临床上可应用伊红-Y水试验、低渗肿胀试验检验精子膜完整性，作为判断精子功能的重要指标之一［4］。精子膜主要分头部膜和尾部膜。精子活体染色试验可用于评价精子头部膜的完整性，依据核着色与否来判定精子头部膜的完整性；精子尾部低渗肿胀试验已在评价精子功能方面得到广泛应用；伊红-Y水试验不仅可通过检测精子尾部肿胀率来反映精子膜完整性，同时也可以通过检测精子头部着色情况来评估精子头部膜结构的完整性，因而广泛应用于临床检测中。研究发现精子尾部肿胀率与精子密度、活力、活率呈显著正相关，与精液白细胞浓度呈负相关［5］，这说明精子膜完整性可能与精液参数密切相关，因此可将其作为评价男性生育力的重要指标之一而应用于临床。

2 精子顶体反应测定

顶体反应在精子穿过透明带与卵细胞膜结合的过程中发挥重要作用，是精子的重要功能之一。无顶体或精子诱发顶体反应缺陷／顶体反应较弱均可导致受精障碍。若精子与透明带结合前发生了自发性顶体反应，精子就失去了授精能力，研究发现自发性顶体反应率＞10%即提示精子质量差［6］。通过体外诱发精子顶体反应率检测可预测体外受精（IVF）结局，为临床男性因素不孕的夫妇选择适宜的辅助生殖技术（ART）提供帮助，因为精液常规分析正常但顶体反应明显低下且反复受精失败的患者若选择ICSI，其受精率、植入率和妊娠率仍然很低［7-8］。目前最简便的方法是荧光标记的豌豆凝集素法［9］，可区分顶体正常或异常的精子。

3 精子核成熟度和DNA完整性测定

精子DNA结构完整性对正常受精和胚胎发育具有重要意义，测定精子核成熟度和DNA完整性可反映精子的授精能力，并作为精液常规分析的补充，更好地反映男性的生育能力［10］。研究表明，精子DNA完整性可直接影响ART的受精率、胚胎质量和妊娠率。DNA损伤精子比例与胚胎质量和ICSI后的妊娠结局呈负相关［11-12］。

目前关于精子DNA损伤对IVF和ICSI的影响还存在广泛争议［13］。精子DNA异常不仅可导致受精失败，还可导致胚胎停止发育、流产和胎儿畸形等。ICSI技术的发展使越来越多的严重少弱畸精子症患者获得生育希望，但由于临床行ICSI时人为选择形态和活力好的精子，不能确保其遗传物质正常，故有增加胚胎遗传病的发生风险，因此在ICSI前需评估精子DNA。该检测具有重要的临床意义，不仅可深入评估男性生育力，还可指导治疗及预测ART治疗结局。

检测精子DNA损伤的方法可分为两大类，一种是直接利用探针来检测DNA断裂的位点，评估DNA的损伤程度，包括末端转移酶介导的d UTP末端标记法（TUNEL）和原位缺口平移法（ISNT）等。另一种根据受损DNA易变性的原理，包括彗星实验、吖啶橙试验（AOT）、染色体扩散试验（SCD）、精子染色质结构分析（SCSA）［14］。上述技术各有优缺点，在使用过程中应结合实验条件适当选择，并且以上方法对精子均有损伤，检测后的精子不能用于辅助生殖。近年来 Mallidis等［15］利用拉曼显微镜，通过特异性的拉曼光谱检测精子中亚细胞成分，受损的精子线粒体可发生明显的改变，从而在分子水平检测精子DNA损伤，此项技术可用于ART中精子的筛选。

4 精子与透明带结合及穿透试验

人卵透明带（hZP）在精卵识别与结合、诱发顶体胞吐以及阻止多重受精等方面起关键作用。目前已知hZP由4种糖蛋白构成。对于hZP生物活性的研究受人卵缺乏及伦理学等影响，受到了极大限制，为此科学家们利用基因工程技术获取了重组人透明带糖蛋白（rhZP），现已将其广泛用于精子与透明带相互作用的研究中。rhZP3也被应用于检测精子功能，评估男性生育能力［16-18］。

无论精子与透明带结合障碍还是透明带诱发顶体反应障碍，都会影响精子对透明带的穿透作用，也有些精子能够结合到卵子透明带上，且发生顶体反应，却不一定穿透透明带而受精，因此精卵穿透试验能够更好地预测精子的授精能力。因为这类患者行IVF治疗受精率会下降，甚至受精完全失败。对于规模较大的生殖中心，如果不明原因不孕患者行IVF失败且卵子较多，可以在其进入治疗周期前利用废弃卵子进行精卵结合及透明带诱发顶体反应试验，从而判断精子的授精能力，检测出精子功能缺陷的患者［19］，但尚存在伦理问题，而且尽管这些试验对评估精子的授精能力、IVF及ICSI的选择及妊娠结局预测均有积极的作用，但因为操作比较繁琐，不适于临床普及应用。

5 ROS测定

ROS在男性不育症诊治中的作用越来越受重视，因为ROS是DNA损伤的一个重要因素。研究发现，ROS与男性不育具有一定相关性，适量ROS在维持男性生殖功能，如激素的产生、精子获能、顶体反应以及精子活力等方面发挥重要作用［20］。精浆中的抗氧化物使ROS的产生和清除处于一种动态平衡，当这种平衡遭到破坏，过量即会导致精子膜、精子线粒体、精子核DNA完整性的损伤，影响精子存活和运动能力，引发男性不育。Zalata等［21］研究显示，精液ROS含量与精子活率、正常形态率均呈显著负相关，与精子密度及不成熟精子率呈正相关。但 Hammadeh等［22］研究认为精浆中ROS浓度会影响精子质量，对精子授精能力有一定影响，而与卵裂率、优质胚胎率及IVF／ICSI周期妊娠率均无相关性。精液的优化处理可使精子的应激状态得到缓解，改善精子的微环境，从而为抗氧化药物治疗男性不育症、改善IVF的妊娠结局提供了理论依据［23］。

6 精子-宫颈黏液相互作用试验

该试验主要用于评估精子能否穿透宫颈黏液，可观察精子穿透密度、迁移距离、迁移密度减少程度及观察精子在宫颈黏液中一定时间的存活情况，因此是诊治不育症的一项重要指标。在体外试验中应用人宫颈黏液有很多缺点，宫颈炎症和p H值等因素影响宫颈黏液质量，从而影响对精子穿透力的判断，故在临床检测中不断探索寻找一种与人宫颈黏液的物理特性相近，能够完全接受人类精子的宫颈黏液替代物。近期有研究证明，蛋清完全可以代替宫颈黏液用于临床精子穿透力检测［24］。操作简单，且能有效避免影响宫颈黏液质量的因素。

7 小结及展望

ICSI目前已成为男性不育治疗不可忽视的方法，虽然ICSI克服了精子数量不足或直接从附睾、睾丸获取精子治疗不育，但是这种受精方式违背了自然受精的生物学法则，具有很大的遗传风险，有可能将染色体畸变、缺失或基因突变等遗传缺陷及表观遗传缺陷传给下一代或诱发相关的疾病［25］。表观遗传学是近年来在国际上迅猛发展的研究领域，通过DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰等不改变核苷酸序列的方式将遗传信息传递给子代［26］。ART治疗时有待于建立精子DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传学质量评价指标，从表观遗传因子水平对不同形态的精子进行评价，切实控制ART精子的质量，降低精子表观遗传缺陷风险。

综上所述，目前尚未确定出一种简单、精确的精子功能检测方法，要正确评估男性的生育能力，应结合临床实际对精子的各项功能进行综合测定，并且筛选必要的检查项目应用于辅助生殖的治疗过程中。随着检测技术的不断发展和完善及对男性不育症的深入研究，有望研究出便于临床应用的价廉且简单易行的检测方法，从而更好地解决男性的不育问题。

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