新疆喀什部分地区驴梨形虫病检测初报

卡丽比努尔·尔肯，海尼木古丽·艾合买提，图尔荪·萨迪尔，沙塔尔·卡哈尔，巴音查汗

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆维吾尔自治区托克逊县夏乡畜牧业服务中心，托克逊 838100；3.新疆维吾尔自治区吐鲁番市畜牧兽医站，吐鲁番838000 ）

·简报·

新疆喀什部分地区驴梨形虫病检测初报

卡丽比努尔·尔肯1，海尼木古丽·艾合买提2，图尔荪·萨迪尔1，沙塔尔·卡哈尔3，巴音查汗1

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐830052；2.新疆维吾尔自治区托克逊县夏乡畜牧业服务中心，托克逊 838100；3.新疆维吾尔自治区吐鲁番市畜牧兽医站，吐鲁番838000 ）

为了解新疆维吾尔自治区南疆部分地方驴泰勒虫和驽巴贝斯虫病的存在情况，本文采用PCR技术和竞争性酶联免疫吸附试验（c-ELISA）检测喀什部分地区驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的流行情况。调查结果显示，喀什地区疏勒县和疏附县驴寄生虫总感染率为45.17%。通过PCR方法检测出19份血样感染泰勒虫病，感染率为36.84%；未检出驽巴贝斯虫病。通过c-ELISA方法检测出96份血清感染泰勒虫病，感染率为7.29%；驽巴贝斯虫的感染率为1.04%。通过本次驴寄生虫感染调查，对喀什部分地区驴寄生虫感染情况有了初步了解，为该地区驴的健康发展提供了科学依据。

泰勒虫；驽巴贝斯虫；PCR；c-ELISA；检测；驴

1 材料与方法

1.1 实验动物2014年9月，在喀什市疏勒县罕南力克镇十村随机抽取19头驴，驴颈静脉采集新鲜血样于肝素抗凝管，-20℃保存，待检。2014年10月，在喀什市疏附县采集96头驴血清，－20℃保存，待检。

1.2 主要试剂及仪器设备泰勒虫抗体c-ELISA试剂盒（批号：P130726-001）、马驽巴贝斯虫抗体c-ELISA试剂盒（批号：P140327-001）均购自美国VMRD公司；ASCENT 型酶标仪为芬兰Thermo 公司产品；全血DNA提取试剂盒为TIANGEN公司产品。

1.3 驴全血基因组DNA的提取随机采集喀什市疏勒县罕尼力克镇十村的19头驴血样，运用全血DNA提取试剂盒提取血液的DNA，-20℃保存备用。

1.4 引物设计参考GenBank发表的驽巴贝斯虫BC48基因序列（登录号：AB731213）和泰勒虫18S基因序列（登录号：AB733376）[7]，应用Primer Premier 5.0软件分别设计一对特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。BC48-F：5'-GGGCGACGTGACTAAGACCTTATT-3'，BC48-R1：5'-GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC-3'；TE-F：5'-TTTgggCTgTTTACAgTTgC-3'，TE-R：5'-CTCAAAgTAAACgTCgAgTCATg-3'。

1.5 驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的PCR诊断泰勒虫18S基因扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL、上下引物各1 μL、模板2 μL、2×dNTP Mix12.5 μL、补充灭菌ddH2O至25 μL。扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。驽巴贝斯虫BC48基因扩增体系：10×PCR buffer2.5 μL、上下引物各1 μL、模板2 μL、2×dNTP Mix12.5 μL、补充灭菌ddH2O至25 μL。扩增程序：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸4 min，10℃保存。

1.6 PCR产物的克隆和测序按DNA纯化胶回收试剂盒（Omega公司）说明书进行PCR产物的回收，并与pEASY-T1载体进行连接，转化感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆，送到上海生工公司进行测序。

1.7 血清学检测随机采集了喀什市疏附县96头驴血清，采用c-ELISA 试剂盒进行检测，泰勒虫检测试剂盒的批号为P130726-001，驽巴贝斯虫检测试剂盒的批号为P140327-001。阴阳值根据公式判断：100-（100x/阴性OD平均值）≥40，小于x为阴性，大于x为阳性。

2 结果与讨论

2.1 驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的PCR诊断结果喀什市疏勒县19头被检驴血液根据试剂盒操作说明提取DNA，以其作为模板进行驴泰勒虫和驽巴贝斯虫PCR。电泳结果见图1和图2，泰勒虫条带大小为539 bp，驽巴贝斯虫条带大小为721 bp。

2.2 PCR产物测序及序列比对结果将鉴定为阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司测序，经Blast分析鉴定为泰勒虫序列（图略）。

IPCC第四次评估报告(IPCC,2007)指出,近百年来全球地表平均气温上升了0.74 ℃,与1980—1999年相比,未来20 a全球将可能增温0.4 ℃,而到21世纪末将增温1.1～6.4 ℃。IPCC第五次评估报告(IPCC,2013)认为,气候变化要比原来认识的更加严重,而且有95%以上的把握认为气候变化是人类的行为造成的。

2.3 驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的EILSA检测结果c-ELISA方法检测了96份驴血清，测定其 OD450/ OD630值，所测泰勒虫样品的阴性对照的平均值为

0.765，阳性对照的平均值为0.274，血清判定临界值为0.459，大于临界值为阴性，小于临界值为阳性。检测驽巴贝斯虫样品的阴性性对照的平均值为0.888，阳性对照的平均值为0.146，血清判定临界值为0.533，大于临界值为阴性，小于临界值为阳性，结果见表1。

2.4 驴样品的PCR检测和EILSA检测结果比较对喀什地区疏勒县罕南力克镇十村随机抽取的19头驴样品进行PCR检测，泰勒虫病阳性率为36.84%（7/19），未检测出驽巴贝斯虫病。对PCR阳性样品进行测序比对，鉴定为泰勒虫序列。再用c-ELISA方法对疏附县96头驴血清样品检测，泰勒虫的阳性感染率为7.29%（7/96），驽巴贝斯虫的阳性率为1.04%（1/96）。通过PCR和c-ELISA两种方法结果显示出，驴感染泰勒虫较严重，而驽巴贝斯虫的感染率较低甚至无感染，该地区马泰勒虫感染情况

有可能会影响当地驴产业发展，因此应引起有关部门的足够重视。

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A PRELIMINARY SURVEY OF DONKEY PIROPLASMOSIS IN PART AREA
OF KASHGAR CITY

KALIBINUER·Erken1, HAINIMUGULI·Aihemaiti2, TUERSUN·Shadier1, SHATAER·Kahaer3, BAYINCHAHAN1
(1.College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Livestock Service Center of Tuokexun County, Xia Township, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Tuokexun County 838100, China; 3. Animal Husbandry and Veterinary Station of Turpan City, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Turpan 838000, China)

The prevalence of Babesia equi and Babesia caballi were examined in donkeys in Kashgar Prefecture, Xinjiang Uygur Autonomous Region using PCR and competitive enzyme-linked immunosorbent assay (c-ELISA). The overall parasite infection rate was 45.17% in donkeys from Shule County, Kashi city and Shufu County, Kashgar Prefecture. Total 19 blood samples were detected Babesia equi positive (36.84%) by PCR No Babesia caballi infection was detected. Total 96 serum samples were tested by c-ELISA and the positive rate was 7.29% for Babesia equi and 1.04% for Babesia caballi. The survey results provided preliminary information on parasitic infections in donkey population in southern Xinjiang.

Babesia equi; Babesia caballi; PCR; c-ELISA; detection; donkey

S852.723

B

1674-6422（2015）03-0065-04

2014-12-22

国家科技支撑计划（2012BAD46801-4）

卡丽比努尔·尔肯 , 女，硕士研究生,预防兽医学专业通信作者： 巴音查汗，E-mail:bynch@hotmail.com