鸭甲肝病毒与新型呼肠孤病毒复合RT-PCR检测方法的建立

孙晓军，王晓艺，韩宏宇，迟海华，杨宏禹，于可响

（1.山东省农业科学院家禽研究所 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.山东省烟台市姜格庄兽医站，烟台264100；3.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；4.山东省蓬莱市大柳行畜牧兽医工作站，威海 265600）

·简报·

鸭甲肝病毒与新型呼肠孤病毒复合RT-PCR检测方法的建立

孙晓军1，王晓艺2，韩宏宇3，迟海华4，杨宏禹4，于可响1

（1.山东省农业科学院家禽研究所 山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南 250023；2.山东省烟台市姜格庄兽医站，烟台264100；3.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；4.山东省蓬莱市大柳行畜牧兽医工作站，威海 265600）

根据鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）的3D基因序列和新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck reovirus, NDRV）的S3基因序列，分别设计了1对特异性引物，通过条件优化建立了鉴别DHAV和NDRV的复合RT-PCR方法。该方法对DHAV和NDRV的最低检出量均为100 copies，而对番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus, MDRV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）和鸭副粘病毒（Duck paramyxo virus, NDV）的检测结果均为阴性。临床样品的检测结果显示，该方法是一种快速鉴别诊断DHAV和NDRV感染的有效手段。

鸭甲肝病毒；新型鸭呼肠孤病毒；复合RT-PCR；鉴别诊断

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis，DHAV）又称鸭肝炎，由鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）引起，5周龄以下的雏鸭对该病毒易感，其中1～3周龄内的雏鸭最易感且死亡率高，部分可达

90%以上[1]。鸭病毒性肝炎波及面广、发病率高、危害严重，是影响我国养鸭业发展的主要疾病之一。DHAV分为A、B、C三个基因型，目前在我国流行的主要是A型和C型[2-4]。

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染是近几年发生的一种危害我国养鸭业的新型疾病。该病毒可感染不同品种、不同日龄的鸭群，但以2周龄内的雏鸭感染最常见，也最严重，死亡率为5%～20%[5,6]。新型鸭呼肠孤病毒与禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）以及传统的番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）在基因序列、生物学特性、抗原相关性方面均存在较大差

异[7,8]。

DHAV和新型NDRV都以侵害雏鸭为主，在临床上容易发生混合感染。本研究利用PCR技术快速、准确、敏感性高的特点，建立了鉴别DHAV和新型NDRV这两种病毒的复合RT-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒与SPF鸡胚新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、A型鸭甲肝病毒（DHAV-A）、C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus, DTMUV）和鸭副粘病毒（Duck paramyxo virus, DPMV）均由山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室分离、保存；SPF鸭胚由山东省农科院家禽研究所昊泰实验动物中心提供。

1.2 试剂TRIzol购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000）购自TaKaRa（大连）公司；感受态细胞DH5α由山东省禽病免疫与诊断重点实验室制备。

1.3 引物设计根据GenBank中发表的DHAV的3D基 因 序 列（ 登 录 号：DQ864514/ Q122332）， 利 用Primer premier 5.0软 件 设 计了1对简并引物，扩增片段大小为304 bp，DHAV1：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'，DHAV2：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'（R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或 者C；D=G、A或 者T）； 根据GenBank中发表的NDRV的S3基因序列（登录 号：KJ879932）， 利 用 Primer premier 5.0软件设计了1对引物，扩增片段大小为148 bp，NDRV1：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3' ，NDRV2：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'。

1.4 病毒增殖将DHAV-A、DHAV-C和NDRV分别接种10日龄SPF鸭胚，37℃恒温培养，收获接种24 h后死亡鸭胚的尿囊液，提取病毒RNA。

1.5 阳性质粒的构建按照RNAiso Reagent试剂说明提取DHAV-A、DHAV-C和NDRV的RNA，加入适量无RNA酶的去离子水溶解。分别以随机引物反转录的cDNA为模板，以各自的特异性引物为扩增引物，按照常规PCR方法进行扩增，取5 μL反应产物用1.5%琼脂糖电泳进行检验。按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，与pMD18-T载体连接后，转化DH5α。挑菌提取质粒，分别进行PCR和酶切鉴定，鉴定为阳性的菌落送上海铂尚生物技术有限公司进行测序，并与GenBank中的参考序列进行比较。DHAV-A、DHAV-C和NDRV的阳性质粒分别命名为pMD-A、pMD-C和pMD-R。

1.6 复合RT-PCR反应条件的优化按照TRIzol试剂说明提取病毒RNA，加入适量的DEPC处理水溶解。参考M-MLV说明书，从引物浓度、退火温度以及反应体系方面进行反应条件的优化。

1.7 敏感性试验分别提取阳性质粒pMD-A、pMD-C和pMD-R，利用分光光度计测定含量，将3种质粒进行10倍系列稀释，浓度为1×100～1×105copies/μL（即PCR反应体系中质粒含量分别为1×100～1×105copies），利用常规PCR方法进行检测。反应结束后，各取5 μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，以确定该方法对这3种阳性质粒的最小检出量。

1.8 特异性试验分别提取DHAV-A、DHAV-C、NDRV、MDRV、PV、DTMUV、DPMV以及NDRV与DHAV混合物的RNA，并以此为模板利用上述优化的反应条件分别进行RT-PCR，反应结束后，取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.9 重复性试验利用该复合RT-PCR方法分别对A

型DHAV阳性病料和NDRV阳性病料进行扩增，各重复3次，确定其重复性。

1.10 临床样品检测从不同鸭场收集疑似病变组织50份，应用本研究建立的复合RT-PCR方法进行检测，同时将样品处理后经尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚进行分离，盲传3代后，通过中和试验对分离物进行鉴定，比较两种方法的符合性。

2 结果与讨论

2.1 敏感性试验提取阳性质粒pMD-A、pMD-C和pMD-R，测定含量后分别做10倍梯度稀释，利用PCR方法进行检测。结果显示，该检测方法对这3种阳性质粒的最低检出量均为100 copies（图1）。

2.2 复合RT-PCR反应条件的优化通过对引物浓度、退火温度以及反应体系等反应条件的反复优化，最终确定的反应条件为：在PCR管中加入RNA 5 μL，10 μmol/L dNTP 2 μL，10 pmol/μL引物DHAV1、DHAV2各2 μL，10 pmol/μL引物NDRV1、NDRV2各0.5 μL，经70℃加热5 min后，冰浴放置2 min ，然后依次加入下列成分：5×RT buffer 4 μL、40U/μL Rnasin 0.5 μL、200U/μL M-MLV 1 μL、DEPC处理水2.5 μL，反应总体积20 μL，轻轻混匀，42℃ 30 min，95℃ 2 min。然后以反转录产物作为模板进行PCR。PCR反应体系：反转录产物1 μL、10×PCR buffer 5 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、灭菌ddH2O 43.5 μL。PCR反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，进行30个循环，最后72℃延伸5 min。

2.3 特异性试验利用建立的复合RT-PCR方法对包括DHAV和NDRV在内的几种常见的鸭病毒病进行检测，结果显示，该方法能从A型和C型DHAV中扩增到304 bp的目的条带，从NDRV中扩增到148 bp的目的条带，从NDRV与DHAV混合物中扩增到304 bp和148 bp两条目的条带，而对MDRV、DPV、DTMUV、DPMV扩增不出任何条带（图2）。

2.4 重复性试验利用复合RT-PCR方法分别对DHAV-A和NDRV阳性的病料进行扩增，各重复3次，结果显示，3次重复均能扩增出目的条带，且条带的亮度基本一致（图3）。

2.5 临床样品检测利用复合RT-PCR方法对50份样

品进行检测，结果检出DHAV阳性病料27份，阳性检出率为54%，而病毒分离鉴定检出阳性病料25份，阳性检出率为50%，两种方法的符合率为96%（表1）。检出NDRV阳性病料7份，阳性检出率为14%，而病毒分离鉴定检出阳性病料4份，阳性检出率为8%，两种方法的符合率为94%（表2）。

2.6鸭病毒性肝炎和新型鸭呼肠孤病毒感染是临床上

常见的鸭病，它们都以侵害雏鸭为主，治疗均以抗体注射为主，因此只有将两者区分开，给予相应的抗体，才能取得很好的疗效。传统的病毒分离鉴定方法费时、费力、成本高，并且很难区分两者的混合感染，因此需要建立更快速、更有效的检测方法。复合PCR是一种特殊的PCR形式，既具有常规PCR准确、快速、敏感的优点，又可同时鉴别多种病原，满足临床上同时对多种疾病进行诊断的要求[9,10]。

本研究根据DHAV和NDRV基因的保守序列分别设计了1对特异性引物，建立了用来鉴别这两

种病毒的复合RT-PCR方法。通过敏感性试验发现，对DHAV-A、DHAV-C和NDRV的最低检出量均为100 copies，说明该方法敏感度较高。复合RT-PCR特异性试验表明，对DHAV-A、DHAV-C和NDRV的扩增条带均为单一条带，而对MDRV、DPV、DTMUV和DPMV扩增不出条带，说明该方法具有良好的特异性。

复合PCR具有短片段优先扩增的特点，即当反应体系中同时含有两对或两对以上的引物和模板时，反应总是有利于片段较小的一方[11]。根据这一原理，为了在检测混合感染时获得较好的扩增效果，笔者对引物浓度、退火温度以及反应体系进行了反复优化，最终获得了DHAV与NDRV复合RT-PCR检测方法的最佳反应条件。

本研究建立的复合RT-PCR方法具有敏感、特异、简便等特点，整个检测过程只需4～5 h，可作为一种快速鉴别DHAV与NDRV混合感染的有效手段。

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MULTIPLEX RT-PCR FOR DETECTION OF DUCK HEPATITIS A VIRUS AND NOVEL DUCK REOVIRUS

SUN Xiao-jun1, WANG Xiao-yi2, HAN Hong-yu3, CHI Hai-hua4, YANG Hong-yu4, YU Ke-xiang1
(1. Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology of Shandong Province, Institute of Poultry, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Jianggezhuang Veterinary Station of Yantai City, Shandong Province, Yantai 264100, China; 3. College of Animal Science Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China 4. Daliuhang Veterinary Station of Penglai City, Shandong Province, Weihai 265600, China)

A multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for detecting Duck hepatitis A virus (DHAV) and Novel duck reovirus (NDRV) was developed using two primers based on 3D gene of DHAV and S3 gene of NDRV. The detection limit of the RT-PCR assay was 100 copies for both viruses. Mean while, the method had no reaction with Muscovy duck reovirus (MDRV), Duck plague virus (DPV), Duck Tembusu virus (DTMUV) and Duck paramyxo virus (NDV). The results of testing clinical samples showed the assay was a useful technique for differential detection of DHAV and NDRV.

Duck hepatitis A virus; Novel duck reovirus; multiplex reverse transcription polymerase chain reaction; differential diagnosis

S852.659.6

B

1674-6422（2015）03-0050-05

2014-12-31

山东省海外高层次人才（泰山学者）引进计划；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队计划（SDAIT-13-011 -01）；公益性行业（农业）科研专项（201003012）

孙晓军，男，硕士，主要从事家禽疫病的防控研究

于可响，E-mail：yukx1979@163.com；杨宏禹，E-mail：429791224@qq.com