大豆过敏原免疫学检测方法研究进展

王 耀 邓瑞广 张改平，3 王方雨 李志西 胡骁飞

（农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，河南省农业科学院1，郑州 450002）（西北农林科技大学食品科学与工程学院2，杨凌 712100）（河南农业大学牧医工程学院学院3，郑州 450002）

大豆过敏原免疫学检测方法研究进展

王 耀1，2邓瑞广1张改平1，3王方雨1李志西2胡骁飞1

（农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，河南省农业科学院1，郑州 450002）（西北农林科技大学食品科学与工程学院2，杨凌 712100）（河南农业大学牧医工程学院学院3，郑州 450002）

作为一种重要的粮食作物，大豆应用广泛并在人类和动物营养方面起着至关重要的作用，但大豆中也含有多种过敏原，能够诱发超敏反应，导致机体损伤。随着人们对食品过敏问题的日益重视，各种针对大豆过敏原的快速、准确的检测方法得到了发展，其中免疫学方法具有灵敏性高、特异性强的特点，能够对过敏原进行定性、定量检测而成为研究热点。本文综述了针对大豆过敏原的免疫学检测方法，并对今后的研究方向进行了初步探讨。

大豆 过敏原 免疫学检测

大豆中蛋白质含量丰富，一般为35%～38%，氨基酸组成平衡，且富含不饱和脂肪酸，是人体和动物体重要的植物蛋白和植物油来源。由于其种植面积广，产量大，长久以来一直被广泛应用于食品和饲料的加工原料。然而，大豆也是联合国粮农组织认定的8种最重要的食物过敏源之一［1］。主要是因为大豆中含有一系列过敏原，容易在婴幼儿和幼龄动物体内引起IgE（Immunoglobulin E）抗体介导的速发型（Ⅰ型）超敏反应，从而导致肠内组胺过量释放等过敏性损伤。近几年，食物过敏逐渐成为重要的食品安全问题，引起了各国食品安全监督管理部门的重视。一些发达国家为保护食物过敏人群，专门立法规定食品包装上要标注食物过敏原，我国在2012年实施的食品安全国家标准《预包装食品标签通则》（GB 7718—2011）中也推荐食品包装上标注致敏物质。因此，针对食品过敏原的检测技术就显得意义重大，可为食品安全提供重要的技术依据。

免疫学检测方法具有灵敏性高、特异性强的特点，能够快速、准确对抗原物质进行定性定量检测，并且不需要复杂的程序和价格高昂的仪器，目前已在过敏原检测中得到了广泛应用［2－3］。本文对大豆过敏原的免疫学检测方法进行了论述，对今后的研究方向进行了初步探讨。

1 大豆过敏原

自1934年Duke［4］发现大豆可引起婴儿腹泻、肠炎等反应，提出大豆可能是一个重要的过敏源以来，人们对于大豆中致敏因子的研究逐步深入。过敏原数据库网站（http：//www.allergenonline.org）在 2014年1月更新的数据信息显示，大豆中共存在38种过敏原，这些过敏原是大豆及其制品中能够导致人或畜禽过敏的蛋白质或糖蛋白，包括大豆疏水蛋白（Glym 1）、大豆外壳蛋白（Gly m 2）、大豆抑制蛋白（Glym 3）、大豆球蛋白（Glycinin）、β－伴大豆球蛋白（β－conglycinin）、大豆空泡蛋白（Glym Bd 30K）、胰蛋白酶抑制剂（KTI）等［5］。其中 glycinin与 βconglycinin占大豆籽实总蛋白的70%～80%，是大豆中最主要的两种致敏蛋白［6］，也是致敏性最强的蛋白［7－8］。

2 免疫学检测方法

据统计，大豆过敏原会导致大约0.4%的儿童产生过敏反应［9］，并且大量的动物试验研究也表明，glycinin和 β－conglycinin可以导致犊牛［10］、仔猪［11－12］和鼠［13］等幼龄动物发生过敏反应。一些大豆过敏原具有很高的稳定性［14］，当其存在于婴幼儿食品以及幼龄动物饲料中，就很可能会诱发过敏反应。但是，婴幼儿配方食品和复合饲料所用的原料成分较多，其中存在的大豆过敏原含量相对于其他原料往往很低，这就增加了快速、准确、定量检测的难度。

免疫学检测方法是基于蛋白的检测方法，在获得抗大豆过敏原的抗体的基础上，利用抗原－抗体反应建立起来的一种针对抗原蛋白的检测方法。包括免疫印迹（Immunoblotting）、放射过敏原吸附试验（Radio－allergosorbent test，RAST）、酶联过敏原吸附试验（Enzyme allergosorbent test，EAST）、酶联免疫吸附 试 验 （Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）等。

2.1 免疫印迹

免疫印迹在过敏原的检测中应用较早，并且广泛应用于发现和鉴定新的过敏原［15］。该法又称为蛋白质印迹（Western blotting），是将聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和固相免疫测定技术相结合。其原理是首先将样品进行单向或双向凝胶电泳，抗原蛋白根据其分子量大小分离，然后将分离的蛋白在电场力的作用下转移到固定化基质膜上，最后利用放射物质或者酶标记的抗体对膜进行检测和分析。Janssen等［16］利用此方法检测了肉制品中大豆过敏原，结果为肉制品中存在大豆过敏原提供了有力证据。Gagnon等［17］将免疫印迹和质谱技术相结合，用大豆过敏患者的血清检测出了19种大豆过敏原，包括5种新过敏原。虽然免疫印迹具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫测定的特异性和敏感性，但目前该方法仅可用于过敏原的定性或半定量检测。

2.2 放射/酶联过敏原吸附抑制试验（RAST/EAST Inhibition）

RAST和EAST通常用于食物过敏的临床诊断，而RAST/EAST抑制试验已被应用于过敏原的定性检测以及食物中潜在过敏原的评估［18－19］。该方法的原理是首先将能与人体特异的IgE抗体结合的过敏原在固定在固相载体上，然后加入被测样品，样品溶液中的过敏原会抑制固相载体上的过敏原与IgE结合，最后加入用放射性物质或酶标记的抗IgE抗体，再加入发光或显色的底物，用射线计数器或分光光度计来检测结合的IgE，从而间接的检测样品中的过敏原。Herian等［20］利用RAST抑制试验定性检测了多种大豆制品（豆芽、豆豉、豆腐、豆酱、酱油等）的过敏原性，结果表明这些大豆制品都会对大豆过敏人群造成潜在的危害。Paschke等［21］利用EAST抑制试验检测了精炼大豆油、非精炼大豆油和大豆卵磷脂的过敏原性，结果显示可能是由于精炼过程中的热处理，消除了精炼大豆油的过敏原性。由于RAST/EAST抑制试验依赖于合适的过敏人群血清并且很难建立标准的检测方法，所以该方法在大豆过敏原定量检测中的应用就受到了局限［22］。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）

目前，ELISA方法是实验室、食品企业以及食品监管机构检测食品中过敏原最常用的方法［3］。该方法主要是基于抗原或抗体的固相化以及抗原或抗体的酶标记，固相化的抗原或抗体可以保持其免疫学活性，酶标记物在保持其免疫学活性的基础上也保留了酶的活性。常用于食品中过敏原定量检测的ELISA方法主要有竞争ELISA（Competitive ELISA）和夹心 ELISA（Sandwich ELISA）两种。竞争ELISA是将过敏原固定在微孔板上，与样品中的过敏原竞争结合特异抗体；而夹心ELISA是先将过敏原的一种特异抗体固定在微孔板上，与样品中的过敏原结合后，然后加入另一种酶标记的特异抗体与过敏原结合。这两种方法均具有实用性强、特异性高、敏感性强等优点。

Ma等［23］在获得glycinin单克隆抗体的基础上建立了检测glycinin的竞争ELISA方法，该方法的半数抑制浓度（IC50）为 1.7 ng/mL，检测限为 0.3 ng/mL。You等［24］成功制备了β－conglycinin单克隆抗体，并建立了检测β－conglycinin的竞争ELISA方法，该方法的 IC50为 4.7 ng/mL，检测限为 2.0 ng/mL；Liu等［25］也建立了β－conglycinin的竞争ELISA方法，但该方法针对的是β－conglycinin上的α亚基，IC50为4.42 ng/mL，线性范围为 0.65～29.84 ng/mL，比前者更加灵敏。Hei等［26］用鼠源 β－conglycinin单克隆抗体作为包被抗体，用兔源β－conglycinin多克隆抗体作为二抗建立了检测β－conglycinin的夹心ELISA方法，该方法的检测限为1.63 ng/mL，线性范围为3～100 ng/mL。

另外，在大豆过敏原ELISA检测方法的基础上，出现了一些商品化的ELISA检测试剂盒。例如Elisa Systems kit和 Veratox两种试剂盒都是依据夹心ELISA方法研制的，前者用于检测食品中的KTI，检测限可以达到1 mg/kg，后者用于对曲奇、饼干、巧克力棒和谷类食品中的大豆粉进行定量，检测范围为2.5～25 mg/kg［27］。虽然 ELISA方法有诸多优点，但有时因为食品基质干扰，也会对检测结果造成影响。

3 结语

综上所述，ELISA检测方法比其他几种方法更具优势，能够快速、灵敏、特异的定量检测过敏原，但这种方法仍需要继续完善。一方面由于大豆过敏原种类较多，检测过程中可能会发生交叉反应；另一方面，现有的ELISA检测方法可能会存在基质干扰，影响检测结果。因此需要针对单一过敏原制备出敏感性高、特异性强的抗体，并且需要制定简单便捷的样品处理方法，减小基质干扰，增加检测的灵敏度和准确性。未来大豆过敏原的检测将向经济、快速、准确、高通量、高灵敏的方向发展。免疫层析试纸检测方法具有成本低、快速、便携且易操作等优点，可以用于大批量样品的检测，在准确性和灵敏度上也能够满足要求，但目前仍没有关于大豆过敏原免疫层析试纸检测方法的报道，所以该方法将会成为未来大豆过敏原检测方法的一个发展方向。

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Advance in the Immunological Detection of Soybean Allergens

Wang Yao1，2Deng Ruiguang1Zhang Gaiping1，3Wang Fangyu1Li Zhixi2Hu Xiaofei1
（Key Laboratory for Animal Immunology of the Ministry of Agriculture，Henan Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences1，Zhengzhou 450002）（College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University2，Yangling 712100）（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University3，Zhengzhou 450002）

As an important crop，soybean iswidely used and plays a vital role in human and animal nutrition.However，soybean contains several allergens which can induce hypersensitive responses and thus lead to injury of body.Along with the increasing emphasis on food allergy problem，various kinds of rapid and accurate detection methods for soybean allergens have been developed.Among them，immunologicalmethod shall be proved to be the hotpot of current research since its advantages such as high sensitivity，strong specificity，and the ability to conduct the qualitative and quantitative detection.The paper has introduced the immunological detection method for soybean allergens and preliminary discussed the future research direction.

soybean，allergens，immunological detection

TQ432.2

A

1003－0174（2015）08－0143－04

河南省基础与前沿技术研究计划项目（1323004132 22），国家科技支撑计划（2014BAD13B05）

2014－03－08

王耀，男，1986年出生，博士，食品安全检测

胡骁飞，男，1972年出生，副研究员，畜牧兽医及食品安全检测