植物代谢组学及其在烟草上的应用进展

张丽，姬厚伟，黄锡娟，王芳，刘剑

贵州中烟工业有限责任公司技术中心, 贵阳市小河区开发大道96号 550009

植物代谢组学及其在烟草上的应用进展

张丽，姬厚伟，黄锡娟，王芳，刘剑

贵州中烟工业有限责任公司技术中心, 贵阳市小河区开发大道96号 550009

作为系统生物学的一个重要分支，代谢组学是一门研究生物体系受内外环境扰动后（基因的改变或环境的变化），其产生的小分子代谢物变化的科学。代谢组学已被广泛应用于天然药物开发、植物学、微生物学和食品安全等研究领域。本文对代谢组学的形成与发展、植物代谢组学研究方法及其在烟草中的应用进行了综述，并对植物代谢组学的发展及其在烟草中的应用进行了展望。认为代谢组学将在烟草基因功能解析、揭示代谢网络调控机理和提高烟草品质等生物技术应用方面发挥不可替代的作用。

植物代谢组学；烟草；应用

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的一个新的分支，其以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标[1]。通过分析特定生理时期内新鲜组织样品中的糖类、脂类、氨基酸、核苷酸等所有小分子代谢物（分子量小于1000）的变化，代谢组学可从全局表征生物体在受到各种内外环境扰动（基因的改变或环境的变化）后其代谢产物的变化[2]。随着现代分析技术的不断发展完善及数据处理方法的不断优化创新，代谢组学已被广泛应用于天然药物开发、植物学、微生物学和食品安全等诸多研究领域[3]。本文综述了代谢组学的形成与发展、研究方法及其在烟草上的应用。

1 代谢组学的形成与发展

代谢组学相关研究可追溯到上世纪70年代的代谢谱分析（metabolic pro fi ling），通常采用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography mass spectroscopy，GC-MS）对患者体液中代谢物进行定性、定量分析，进而对疾病进行诊断和分析[4]。1983年，荷兰应用科学研究组织Van der Greef[5]首次采用质谱研究了尿中代谢指纹，随后高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术被应用于代谢谱分析。1997年，Oliver[6]提出通过定量分析尽可能多的代谢产物来评估酵母基因的遗传功能及其冗余度，首次将代谢产物和生物基因的功能联系起来。1999年，Nicholson等[7]提出metabonomics的概念，将其定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年，德国马普所的Fiehn等[1]提出了metabolomics的概念，将其定义为对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。

植物代谢组学始于20世纪90年代初，Sauter等[8]首次将代谢组分析引入植物系统诊断，最具代表性的是Fiehn等[2]在拟南芥方面的研究工作。植物中代谢物超过20万种，有维持植物生命活动和生长发育所必需的初生代谢物以及利用初生代谢物生成的与植物抗病和抗逆关系密切的次生代谢物等，对植物的生长发育都有重要作用。根据研究对象和目的的不同，将代谢组学分为四个层次，即：代谢物靶标分析（target analysis）、代谢轮廓（谱）分析（metabolite pro fi ling）、代谢组学（metabolomics）和代谢指纹分析（metabolic fi ngerprinting），其中代谢物靶标分析为靶向分析方法，而其余三个层次均为非靶向分析方法。非靶向的代谢谱分析和代谢物靶标分析是植物代谢组学近年研究的热点[9]。

2 代谢组学研究方法

代谢组学是一门交叉学科，涉及生物科学、分析化学、化学计量学和信息学。其主要流程包括样品制备、代谢物的分离和检测、数据分析及模型的建立等[10]。由于植物中代谢物的种类繁多，结构迥异，且分析手段和数据分析方法又多种多样。根据研究对象不同，采用的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法也各不相同。

2.1 样品制备

植物代谢组学样品制备主要包括样品采集、干燥、提取和样品预处理等步骤。采样是最重要的步骤之一，是最为重要的实验误差来源。为使采样差异最小化，必须严格控制植物的生长状态、优化采样方法、采样时间、采样面积和数量等。为真实反映植株体内的真实信息，须立即阻断内在酶的活性，通常采用冰冻/液氮降温法保存样品。另外，在提取代谢物之前，需除去样本材料的水分子，冷冻干燥是最常用的技术。与其他加热蒸发技术相比，该方法条件相对温和，在低温条件下，酶活性被抑制，可减少酶催化氧化和降解，从而避免样品氧化等活化因素引起的成分变化[11]。

代谢物的提取在样品制备过程中尤为重要，其直接影响代谢谱的范围。植物代谢物提取要尽量快速，以避免（至少减少）萃取过程中代谢物的降解和修饰。目前，代谢物提取最普遍的方法是先将植物组织均一化（用研钵研磨或球磨机或机械装置）[12]，然后在高温或低温下振荡、超声或涡流（内含玻璃珠）萃取[13-14]。萃取溶剂一般为单一有机溶剂或混合溶剂，对于极性代谢物，通常使用甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈或水以及不同比例的混合溶剂，而对于更多的亲脂性化合物，常用氯仿来萃取[15]。对于混合溶剂，甲醇、水和氯仿的混合溶剂最常用，3:1:1的比例可避免溶剂分相[16]。2004年，Gullberg等[16]进行DOE实验设计研究了萃取和衍生条件对拟南芥GC-MS代谢组学研究的影响，实验结果表明先用200 μL的氯仿萃取，然后加800 μL 3:1的甲醇-水形成单一相的萃取效果最好。2011年，Li等[17]用GC-MS对烟叶进行代谢轮廓分析，对萃取溶剂（甲醇、水、乙腈、氯仿）种类、比例进行了优化，结果表明水、甲醇和乙腈体积比为3:1:1时对大多数烟草成分萃取效果最好。同年，Li等[18]还对LC-MS/MS分析烟草中代谢物的前处理方法进行了优化，结果表明用水提取亲水性成分，用己烷提取亲脂性成分的效果最好。挥发性成分（VOCs）是植物代谢组中的一类关键致香成分，其常用的萃取方法主要有溶剂萃取、静态顶空、动态顶空[19]和顶空固相微萃取（SPME）[20]。2012年，Ma等[21]建立了一种基于SPME-GC-MS的烟草非靶向代谢谱分析方法。2014年，张丽等[22]建立了一种分析卷烟烟丝中嗅香成分的吹扫捕集-GC-MS法，该方法可实现对卷烟烟丝中170种嗅香成分的同时、快速分析，且具有操作简单、样品提取非破坏性、灵敏度高、重复性好等优点。

大多数初级代谢物（如有机酸、糖、氨基酸和类固醇等）是非挥发性的，不适合直接进行GC-MS分析，因此GC-MS分析前通常需要对代谢物进行衍生化处理。对含-OH、-SH、或-NH功能基团的极性化合物常用的衍生化方法是使其三甲基硅烷化（TMS）[3]。而还原糖在溶液中存在不同的异构体，单糖的TMS衍生物会形成多重峰，因此在TMS衍生化之前需用羟基胺或烷基羟胺将醛和酮肟化（防止葡萄糖成环），从而减少异构体的数目。

2.2 代谢物的分离和检测

代谢组学分析对象种类繁多，浓度范围分布广，性质差异大，要对它们进行无偏向的全面分析，单靠一种分离分析手段难以完成，因此色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检测和光散射等分离分析手段及其组合都被应用于代谢组学的研究[9]。一般根据样品的特性和实验目的，可选择最合适的分析方法，目前最常用的分离分析手段是NMR和MS技术。

2.2.1 核磁共振（NMR）

NMR是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下吸收射频辐射而产生能跃迁的谱学技术，是最早被用于代谢组学研究的技术之一。目前常用的有氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）和磷谱（31P-NMR），其中以1H-NMR应用最为广泛[23]。NMR为非侵入性分析，可对粗提取液、细胞悬浊液、完整的组织或整个器官中的代谢物进行分析，是现有代谢组学分析技术中唯一能用于活体和原位研究的技术。特别是最近开发的魔角旋转（Magic angle spinning，MAS）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）和活体磁共波谱（Vivo magnetic resonance spectroscopy，MRS）等技术能够无创、整体、快速地获得机体某一指定活体部位的NMR谱。2010年，Pérez等应用高分辨MAS-1H-NMR谱对番茄果实及其组织进行了代谢组学研究，并利用化学计量学对番茄不同组织（果皮、果肉和种子）以及不同成熟度的番茄（绿色、转变期、红色）代谢谱进行了区分。该方法不仅极大程度地减少了样品处理过程，可实现极性和非极性化合物的同时分析，且可获得与1H-NMR谱相似的分辨率[24]。当采用漫射编辑（Diffusion-Editing）技术时，NMR方法还能提供丰富的分子信息，如代谢产物的结构、浓度、分子动力学及相互作用等[25]。另外，每个化合物的NMR谱图是唯一的、特定的，且信号强度与分析物浓度直接成正比，故NMR可以同时提供定性和定量信息。NMR分析的好坏直接取决于定性的信号数目，因此植物代谢物NMR谱库的建立和完善将推动NMR技术在代谢组学中的广泛应用[26]。

NMR技术最大的不足在于灵敏度低，有可能形成信号重叠。为了提高其灵敏度、选择性和谱图的分辨率，二维NMR常被使用。相关谱（correlated spectroscopy，COSY）、 异 核 多 量 子相 干 谱（heteronuclear multiple quantum coherence，HMQC）、异核多量子相关谱（heteronuclear multiple bond correlation， HMBC）可提供不同核间的相关关系信息，从而可提高代谢物定性能力[27]。此外，随着更高强度的磁场（900 MHz）、低温冷却探针和小容量微探针（60 μL）等技术的引入，很大程度上弥补了其灵敏度不高、分辨率低的劣势[28-29]。

2.2.2 质谱技术（MS）

与NMR相比，MS具有高选择性和灵敏度、普适性和分析速度快等特点，可同时检测、鉴定多种代谢物，提供丰富的数据信息等优点，已成为代谢组学研究最为有效的手段之一[30]。质谱技术在代谢组学中的应用主要有直接进样和色谱质谱联用两种方式。直接进样质谱方法分析速度快，可实现对大批量样本的快速筛选，常用于代谢指纹分析。近年来，飞行时间质谱（Time of fl ight-mass spectroscopy，TOFMS）、傅立叶变换-离子回旋共振-质谱（Fourier transform-ion cyclotron resonance-mass spectrometry，FT-ICR-MS）、轨道阱质谱（Orbitrap）等高分辨质谱仪可通过精确质量定性未知化合物，进一步扩展了直接进样质谱技术在代谢组学中的应用[31]。2008年，Giavalisco等[32]利用FT-ICR-MS直接进样方法在拟南芥地上部分鉴定出1000多种化学成分，其中80%的成分未在拟南芥中报道过。解析电喷雾离子化（Desorption electrospray ionization，DESI）、 实时直接分析（Direct analysis in real time，DART）、电喷雾萃取电离（Extractive electrospray ionization，EESI）等新的离子化技术的发展也促进了直接进样质谱在代谢组学中的应用[33]。但这些设备都比较昂贵，限制了其在代谢组学中的普遍使用。另外，直接进样质谱方法还存在着共抑制效应、离子化效率低、无法区分加合物与产物离子及异构体等缺点。为了避免这些问题，同时降低样品基质的干扰，近年来色谱-质谱联用技术在代谢组学研究中的应用较为广泛，如GC-MS、LC-MS或毛细管电泳-质谱联用（Capillary electrophoresis，CE-MS）[34-35]。

GC-MS具有分离效率高，重现性好，有可利用的质谱数据库[36]，易于使用且相对较为经济等优点，且可同时测定几百种化学性质不同的代谢物，包含了糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢等代谢通路中的重要代谢物，如糖、氨基酸、有机酸、生物碱、萜类、甾体等[37]。2000年，Fiehn等[1]采用GC-MS对不同基因型的拟南芥进行了代谢谱分析，并对拟南芥叶子提取液中的326种化合物进行了定量，其中一半的化合物被定性。此后，GC-MS被广泛应用于模式植物（拟南芥、水稻等）[1,38]、部分经济作物（马铃薯块茎、西红柿等）[39-40]以及一些药用植物（青蒿、黄芪等）[41-42]的非靶向代谢组学研究中。而在对复杂样品进行分析时，由于一维色谱峰容量的限制，很难达到理想的分离效果，全二维气相色谱质谱联用（GC×GC-MS）技术的使用则进一步提高了色谱的分离效率，扩大了峰容量，从而增加了代谢谱范围[43]。因而GC×GCMS技术将会在代谢组学研究中复杂混合物的分离分析方面发挥更大的作用。

HPLC具有分离效率高、分析速度快、应用范围广等特点，与GC相比不受样品挥发性和热稳定性影响，与MS联用时，能够集HPLC高分离性能和MS高灵敏度、高专属性的优点于一体，且具有提纯和制备单一物质的能力，而且前处理简单，可以避免衍生化等繁杂的预处理，因而LC-MS技术已发展成为代谢组学研究的主流分析手段[44]。用于代谢组学研究的LC-MS方法多集中在反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography，RPLC），但是传统反相色谱柱存在对强极性的化合物无法保留，从而导致强极性样品的信息损失。亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）技术是一种以极性固定相（如硅胶或衍生硅胶）及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱模式，特别适用于强极性和强亲水性小分子物质的分离。HILIC对复杂样品中的极性物质具有很好的灵敏度和选择性，已经被广泛应用于代谢组学研究中[45]。2002年，Tolstikov等[46]利用HILIC-MS法测定了笋瓜叶柄韧皮部渗出液中的寡糖、糖苷、氨基糖、氨基酸和糖核苷酸，该方法前处理简便、灵敏度高。一维液相色谱-质谱应用于复杂生物样品的代谢组学研究中同样存在无法提供足够的峰容量的不足，而全二维液相色谱（LC×LC）可将分离基质不同的二维色谱柱（反相柱、亲水柱、离子交换柱、亲和色谱柱等）组合构成分离系统，从而提高分离效果[47]。除了多维色谱外，也可采用超高效液相色谱（UPLC）改善极端复杂样品的分离状况。UPLC相对于HPLC更高效、快速、灵敏，和质谱联用时基质干扰减少，从而可提高质谱的检测灵敏度[48]。2011年，Creek等[49]针对LC定性难的问题，建立了一种保留时间预测模型，提高了亲水作用色谱-高分辨质谱的代谢物鉴定能力。还有一些新型色谱如微流体色谱（micro fl uidics）和超临界流体色谱（Supercritical fl uid chromatography，SFC）以其强大的分辨能力，在代谢组学研究中被发展和应用[50,51]。

与GC、LC相比，CE具有仪器简单、分离效率高、分析速度快、溶剂消耗少、应用范围广等特点[52]。CE-MS联用提高了检测灵敏度，在一次分析中可同时得到迁移时间、Mr和碎片特征信息，主要适用于分析极性和离子代谢物（如磷酸化化合物、核苷、核苷酸、TCA循环和鸟氨酸循环代谢物等），还可以区分结构高度相似代谢物和同分异构体化合物（如柠檬酸和异柠檬酸）。由于其分离机理和色谱不同，在生物样品代谢组学研究中常作为GC、LC的补充[53]。2008年，Watanabe等[54]采用CE-ESI-TOF-MS对拟南芥插入T-DNA敲除突变体进行了非靶向代谢谱分析，结果表明，γ-谷酰基-β-氰基-丙氨酸在Bsas的一个突变体（bsas3；1）中降低，而（Bsas3；1）与β-氰基-丙氨酸和γ-谷酰基-β-氰基-丙氨酸的合成有关。Sato等[55]用CE-MS 和CE-DAD（ 二极管阵列检测器）分析水稻叶子中56种碱性代谢物的动态变化，为认知生物系统组成的复杂相互关系提供了依据。Sawalha等[56]用CE-MS/MS通过对甜味和苦味橘皮提取物中的黄酮类代谢物定性和定量分析，为获取天然黄酮提供了新途径。Levandi等[57]用CE-MS研究发现3种转基因玉米和普通玉米之间存在一些明显差异的代谢物。

2.3 代谢组学数据分析

通过仪器分析得到的代谢组学数据是一个庞大的、多维矩阵，需将其转化为适合多变量分析的数据形式，方可用化学计量分析对不同数据加以整合后从中有效挖掘出所需信息。目前数据分析常用的主要手段为模式识别技术，包括无监督学习方法和有监督学习方法[11]。

2.3.1 无监督学习方法

无监督学习方法主要是采用原始图谱信息或者预处理后的信息对样本进行分类。该方法将获得的分类信息与样本的原始信息进行比较，建立代谢产物与原始信息的联系，从而筛选出与原始信息相关的标记物，进而考察其中的代谢途径。无监督学习方法中应用最广泛的是主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）、非线性映射（NLM）、自组织投影（SOM）和K近邻法（KNN）等。其中，PCA和HCA在代谢组学数据处理中较常用[58]。

PCA是将分散的数据信息整合集中到几个主成分上，进而通过主成分来描述生物集体的代谢变化情况。在代谢组学数据处理中，PCA是最早且使用最广泛的多变量模式识别方式之一，其具有不损失样品信息、对原始数据降维的同时避免原始数据的共线性问题等优点。得分图（score plot）将样本的分类信息给以直观的表示，载荷图（loading plot）则给出对分类有贡献的变量及其贡献的大小。

2.3.2 有监督学习方法

有监督学习方法主要是建立样本间的数学模型，使各类样本间达到最大的分离，然后利用建立的多参数模型对未知样本进行预测。这类方法在建立模型时有可供学习的训练样本，故称为有监督的学习方法。除了需要建立用来确认样品类别的确认集（validation set），还需要建立用来测试模型性能的测试集（test set）。有监督学习方法主要包括传统的判别分析（DA）、偏最小二乘法（PLS）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）和人工神经网络（ANN）等[59,60]。

PLS-DA是代谢组学中最常用的有监督学习方法，它可有效的克服自变量的多重相关性，对较少的样本进行建模和有效的筛选。与PCA相比，PLS计算得到的拟合残差最小，稳定性最高，改善各变量的作用方向使其更符合专业解释。PLS-DA主要通过载荷图和变量重要性指数（VIP）给出对分类起重要作用的差异代谢物。然而近年来，正交信号校正（OSC）被用于PLS的数据过滤，通过过滤掉与类别判断正交（无关）的变量信息，只包含与类别判断相关的变量，从而提高判别的准确性[61]。此外，还有支持向量机（Support vector machine，SVM）方法已逐渐应用于代谢组学后期数据的判别分析中，其预测精度明显优于传统的PLS-DA方法[62]。

3 植物代谢组学在烟草中的应用

代谢物是细胞调控的最终产物，代谢物种类和含量可认为是生物系统对基因或环境改变的最终响应[2]。代谢物离生物的表现型或生理状态最近，更能够揭示基因、环境和表现型之间的关系。烟草品质（香味与有害物质）及抗性性状受多因素调控，仅对单个基因或信号转导途径的研究无法阐明这些性状的生理学或生物化学基础，而利用代谢组学手段，研究不同香味风格烟草品质及抗性形成过程各关键阶段（如烟草的打顶及成熟期）代谢产物的动态变化，将能揭示烟草品质和抗逆形成的代谢物质基础，为烟草遗传改良提供新思路。

3.1 非靶向代谢谱分析方法在烟草中的应用

近年来，基于GC-MS、LC-MS及NMR的烟草代谢谱分析方法逐渐建立与改进，并被应用于烟草抗性或品质相关的代谢组学研究中[63-70]。目前，烟草品质性状相关代谢组学研究主要集中在生长环境对烟草代谢影响研究方面。烟叶代谢物水平除受栽培品种影响外，还与土壤、海拔高度以及温度、日照、降雨等气候条件有关。因此，烟叶质量和风格受地域影响很大，如津巴布韦烟叶与中国烟叶。2011年，Li等建立了一种基于LC-MS/MS的烟叶代谢谱分析方法，该方法重复性好、准确、可靠，可从全局表征烟叶代谢组。利用建立的方法对津巴布韦和中国的烟叶进行了区分，并找出了它们之间主要的差异代谢物[17]。在中国，朱尊权等通过比较各种进口烟叶与国产不同地方各等级烟叶的香味特征，将我国烟叶分为浓香型、清香型、中间香型3种，其中，河南地区烟叶表现出典型的浓香特征；云南地区烟叶表现出清香特征；贵州地区烟叶则既有清香特征也有浓香特征，将其定为中间香型[71]。河南、云南、贵州地区烟叶的代谢差异研究筛选出了影响不同地区烟叶香味特征的差异代谢物，将为我国香型的确立提供理论依据[68-70]。另外，GC-MS与LC-MS的联合使用有效地扩展了烟草代谢谱的范围，提供了更多有价值的代谢信息[69-70]。

除了研究生长环境对烟草代谢物影响外，代谢组学也被应用于转基因烟草的评价[63]、盐胁迫与生长调节剂[64]、信号分子等对烟叶代谢物的影响研究[65]。2005年，胡群等[72]研究了植物毒素类似物6-取代阴丹士蓝异亮氨酸共轭物对烟次生代谢产物成分的影响，结果表明，与对照组相比，经过1 mM 6-取代阴丹士蓝异亮氨酸共轭物处理过的烟叶多生成法呢烯、檀香醇和十四醛三种挥发性化合物，且其它发挥性成分的含量也发生了变化。评吸结果显示，诱导烟草次生代谢产物有助于提高和改善卷烟品质。

3.2 代谢物靶标分析方法在烟草中的应用

非靶向的代谢谱分析方法无需对代谢物进行准确定量，可从全局表征烟叶在受到各种内外环境扰动（基因的改变或环境的变化）后其代谢产物的变化，有利于全面了解烟叶信息并发现重要的未知代谢物。为进一步了解烟叶中特定代谢物（如香味物质）含量在不同环境、栽培、调制与加工过程中的变化，则需代谢物靶标分析方法的辅助。植物次生代谢物与机体的抗性、信号传导以及植物的花色、香味等现象有关，因此，通过代谢物靶向分析方法，研究烟草中的烟碱以及主要香味前体物质，如萜类、酚类、醇类、酮类、酯类等次生代谢物含量的变化对于了解烟草主要香气物质的次生代谢途径、改善烟叶香味品质具有重要作用。

3.2.1 次生代谢物质的产生途径与烟草香味物质的关系研究

在次生代谢中，香气前体物质转化、分解为香味物质，如异戊二烯代谢途径可产生萜烯类化合物类胡萝卜素，而类胡萝卜素可降解产生二氢猕猴桃内酯、茄酮、紫罗兰酮、大马酮、香叶基丙酮等多种重要香味物质[73]。与烟草主要香味物质有关的次生代谢途径主要有苯丙烷代谢途径、异戊二烯代谢途径和生物碱合成途径等[74]。在这些途径中，一些酶对烟草香味物质的产生起着重要作用，通过基因手段调控这些关键酶的活性是改良烟草香气品质的手段之一。2014年，符新妍等[75]通过测定烤烟中部叶有机酸总量、苹果酸和柠檬酸含量、代谢相关酶活性的动态变化，探讨了烤烟生长过程中叶片主要非挥发性有机酸含量及代谢相关酶活性变化规律。结果表明，苹果酸含量与苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性之间呈极显著负相关，而柠檬酸含量与柠檬酸合成酶（CS）活性之间呈极显著正相关。因此，可通过调控NAD-MDH和CS活性来调节苹果酸和柠檬酸的含量，协调“酸碱比”，提高烟叶质量。

3.2.2 不同生态环境对烟草次生代谢物的影响研究

次生代谢物是生物体在长期的进化过程中，对生态环境适应的结果。因此，烟草中次生代谢物受光照、海拔、水分、温度等生态因子影响较大。检测不同环境条件下烟草香味物质的变化，可以了解不同的外界环境对烟草体中香味物质合成与积累的影响。2012年，耿召良等[76]以贵州不同产区烟叶为对象，考察了生态条件和种质因素对烤烟次生代谢产物（有机酸类、生物碱、多酚类、甾醇类）含量的影响。结果表明，生态条件对烟叶次生代谢产物含量影响明显，而种质因素对烟叶次生代谢产物影响较小，该结果与Zhang等[68]对云南、贵州和河南三地区烟叶中代谢物分析结果一致。2009年，黄勇等[77]考察了UV-B对烟草次生代谢的影响，结果表明UV-B处理的烟叶其叶绿素、糖和烟碱含量下降程度与辐射强度正相关，但微量适宜强度UV-B处理可使烤烟叶绿素、总类胡萝卜素和总糖含量提高。另外，UV-B辐射可使与植物抗逆性有关的多酚含量显著提高。2011年，乔瑞丽等[78]研究了不同环境因子对烟草中茄尼醇含量的影响，结果表明遮阴处理会使烟叶中茄尼醇含量降低，适量紫外光处理会增加茄尼醇含量，而适量的稀土元素也能促进茄尼醇的合成。2013年，梁太波等[79]研究了干旱条件下外源甜菜碱和脯氨酸对烤烟抗氧化代谢的影响，结果表明，干旱胁迫下，喷施甜菜碱和脯氨酸均能不同程度提高烤烟叶片叶绿素含量和烤烟叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性，促进脯氨酸的积累，同时降低丙二醛（MDA）含量，这是施用甜菜碱和脯氨酸可提高烤烟抗旱能力的主要原因。

3.2.3 不同栽培条件对烟草次生代谢物的影响研究

种植密度和留叶数、适当的施肥、打顶和抹杈以及使用生长调节剂等栽培措施都会影响烟叶的品质。根据各地区的自然环境特点，找到最合适的栽培方式，将有助于最大限度地发挥各烟区的自然优势，彰显各地区烤烟的风格特色。2013年，张小全等[80]考察了氮素对烤烟基因型间香味物质的影响，结果表明，各基因型烟叶中类胡萝卜素和液面分泌物含量在中氮水平下最高；而不同基因型烤烟氮素的代谢积累差异较大；随氮用量增加，烤烟新品系8306烟叶中性香气物质总量升高，K326烟叶则降低。因此，在以提高烟叶香气基础物质含量为目标的栽培管理中要根据品种特点进行氮肥运筹。2014年，李飞等[81]研究表明烤烟成熟前期氮代谢旺盛有利于类胡萝卜素的形成，而成熟后期氮代谢强度减弱有利于类胡萝卜素降解产物的形成；烤烟成熟期氮代谢活性低，硝酸盐积累，多酚的形成受到抑制。2014年，仝延鹏等[82]探讨了精制有机肥对烤烟化学成分及香气物质含量的影响，结果表明，精制有机肥可降低烤烟中、上部烟叶烟碱含量，提高中部叶钾含量和香气物质含量，尤其是巨豆三烯酮、苯甲醇、苯乙醇和新植二烯的含量。

3.3 代谢组学思想（非靶向分析方法）在烟草中的应用

卷烟是通过烟叶的栽培、调制与加工而得到的制品，期间化学成分发生了一系列的变化，包括外源化合物（如香精香料）的加入。基于代谢组学思想，对烟叶或烟气中化学成分进行全分析，然后应用化学计量学的方法对获得的海量数据进行降维和可视化分析，并筛选出重要的差异化合物，对开发优质特色烟叶、叶组配方、新的香精香料，优化卷烟工艺条件及评价卷烟质量工艺具有重要意义。[83]目前，代谢组学思想在烟叶分模块加工、梗丝质量改善、卷烟烟气差异化分析等方面已有应用[84-86]。虽然这些应用尚不成熟，但随着多交叉学科发展逐渐成熟及卷烟工艺和质量要求的日益增高，代谢组学思想在烟草中的应用也将与日俱增。

4 小结与展望

随着NMR、GC-MS、LC-MS及直接进样高分辨质谱等分析技术的飞速发展和创新，代谢组学为植物代谢研究提供了新的视角，也为人们更全面、更多维地理解植物代谢提供了可能。但没有一种分析技术能够单独实现对生物样本中所有代谢物的一次性分析，每种方法都有其缺陷，如NMR灵敏度不高，LC-MS化合物鉴定问题及GC-MS前处理繁琐等。因此，如何开发一种高通量、高分辨率和高灵敏的分析技术是目前代谢组学亟需解决的问题。基于代谢组学整体性、系统性、动态性的研究特点，其研究过程中所用到的检测技术、数据处理方法都要满足高通量、大规模的要求，单一化研究已不能满足实际需求，因此多种技术整合已成为代谢组学发展主要趋势[87]。

代谢组学将烟草作为一个整体研究，可提供更全面的烟草化学成分信息，将化学成分变化与内在质量相关联，进而可筛选出有益成分和有害成分。因此，代谢组学方法可为我国卷烟开发和质量控制提供一套客观、可靠、系统的评价方法。

作为一个新兴的学科，植物代谢组学在烟草中的应用还面临许多技术上的困难和挑战，如样品制备的自动化、代谢组学数据与其他组学数据整合方法的优化以及代谢物的结构鉴定等。但随着分离检测技术的提高以及生物信息学的发展，代谢组学将在烟草基因功能解析、揭示代谢网络调控机理和提高烟草品质等生物技术应用方面发挥不可替代的作用。

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Plant metabolomics and its application in tobacco

ZHANG Li, JI Houwei, HUANG Xijuan, WANG Fang, LIU Jian
Technology Center, China Tobacco Guizhou Industrial Co., Ltd, Guiyang 550009, China

As one important platform of systems biology, metabolomics focuses on changes of low molecule weight metabolites in a biological system which were imposed by perturbations, including genetic or environmental factors.It has been widely used in different research fields, i.e.natural medicines development, botany, microbiology, and food safety.This paper reviewed the formation and development, research methods and its application in tobacco.The prospect of its further development and application were explored.Metabolomics will play a signi fi cant role in functional annotation of tobacco genome, revelation the mechanism of metabolic regulatory networks, and improvement of tobacco quality.

plant metabolomics; tobacco; application

张丽，姬厚伟，黄锡娟,等.植物代谢组学及其在烟草上的应用进展[J].中国烟草学报，2015,21（5）

贵州中烟工业有限责任公司科技项目（201019）

张丽（1987—），硕士，助理工程师，主要从事烟草及卷烟烟气分析与检测工作，Tel：0851-83981473，Email: zhanglishancha@163.com

刘剑 （1974—），博士，高级工程师，主要从事烟草及烟气化学分析，Tel：0851-83981463，Email：liuj1208@163.com

2014-09-12

:ZHANG Li, JI Houwei, HUANG Xijuan, et al.Plant metabolomics and its application in tobacco [J].Acta Tabacaria Sinica,2015, 21(5)