瓠瓜LINE逆转座子RT序列的克隆与特征分析

赵 芹, 谢大森, 何晓明, 罗少波, 彭庆务, 陈俊秋

(广东省农业科学院蔬菜研究所, 广东 广州 510640)

瓠瓜LINE逆转座子RT序列的克隆与特征分析

赵 芹①,②, 谢大森①, 何晓明, 罗少波, 彭庆务, 陈俊秋

(广东省农业科学院蔬菜研究所, 广东 广州 510640)

以瓠瓜〔Lagenariasiceraria(Molina) Standl.〕品种‘大籽葫芦’(‘Dazihulu’)和‘杂交瓠瓜’(‘Hybrid bottle gourd’)为供试材料，对其基因组总DNA中的LINE逆转座子RT序列进行扩增，并对30个克隆产物的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比对、同源性分析和系统进化分析。结果表明：瓠瓜品种‘大籽葫芦’与‘杂交瓠瓜’的基因组总DNA均包含长度约580 bp的RT序列片段。从2个瓠瓜品种中获得的30条LINE逆转座子RT核苷酸序列(编号为LsRT1至LsRT30)长度为564～599 bp，碱基A、T、G和C的数量分别为143～193、157～205、104～139和83～134，AT/GC比为1.29～1.76，表现出高度异质性。缺失突变和终止密码子突变是造成瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列长度差异的主要因素。30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的相似性为47.1%～99.5%，其编码的氨基酸序列相似性为26.7%～100.0%。根据核苷酸替代值，30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列可分为4个家族(family)，分别包含14、8、1和7条序列。氨基酸序列分析结果显示：瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列包含20个保守氨基酸残基和多个半保守氨基酸残基；有14条氨基酸序列具有终止密码子突变。Family 1、Family 2和Family 4是可能具有转座活性的逆转座子家族，分别包含8、3和5条无终止密码子的RT氨基酸序列。根据瓠瓜与其他15种植物的LINE逆转座子RT氨基酸序列构建的系统进化树,瓠瓜与葡萄(VitisviniferaLinn.)和黄瓜(CucumissativusLinn.)等种类的LINE逆转座子RT氨基酸序列有较高同源性。研究结果表明：瓠瓜LINE逆转座子是一类较古老元件，LINE逆转座子可在瓠瓜与其他种类的基因组间横向传递。

瓠瓜; LINE逆转座子; RT序列; 序列分析; 相似性; 系统进化

瓠瓜〔Lagenariasiceraria(Molina) Standl.〕为葫芦科(Cucurbitaceae)1年生攀缘草本植物，主要分布于中国长江流域及长江以南地区，品种十分丰富。瓠瓜易栽培且产量高，嫩瓜柔软多汁且风味可口，是华南地区蔬菜淡季的重要蔬菜[1-2]。根据形态和基因，非洲和亚洲的瓠瓜被分为2个亚种[3-4]。目前对瓠瓜种质资源研究较少，仅见利用分子标记初步分析部分瓠瓜种质遗传多样性的研究报道[5-8]，但对瓠瓜不同种质的形成及进化关系仍不甚明了。另外，瓠瓜花色、花型、瓜型及抗性等性状差异很大，但这些性状的形成机制尚不明确。

逆转座子在植物中分布广泛，种类多、拷贝数量高、插入位点专一；逆转座子以RNA为中间产物，反转录为染色体DNA，在寄主基因组内不断转座增殖，影响寄主基因组的大小、结构、功能和进化[9]。逆转座子可用于基因组的组成、表达调控和功能进化分析，以及遗传连锁的分子标记和生物多样性评价及体细胞无性系变异评估等方面[10-12]，是当前研究的热点之一。外界因素易激活逆转座子，进而导致逆转座子发生基因突变、基因组扩增及重排等，并最终引起植物的遗传变异[13-16]，有关葡萄(VitisviniferaLinn.)果皮颜色及菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)花色形成的研究[17-18]即证实了这一点。因此，研究瓠瓜的特异生物学性状及遗传进化与逆转座子的关系具有十分重要的意义。

逆转座子包括长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)逆转座子和非长末端重复序列(non-long terminal repeat，non-LTR)逆转座子，其中LINEs(long interspersed nuclear elements)逆转座子为非长末端重复序列逆转座子之一[19-20]。迄今non-LTR类逆转座子已被广泛应用于多种植物的多个研究领域[11,21-23]，但目前尚未见瓠瓜LINE逆转座子RT序列分离及转录活性研究的报道。本文对瓠瓜LINE逆转座子RT序列及其相互关系进行研究，以期为瓠瓜种质资源的分子鉴定、种质评价与遗传进化研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为瓠瓜品种‘大籽葫芦’(‘Dazihulu’)和‘杂交瓠瓜’(‘Hybrid bottle gourd’)，均由广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室保存。将2个瓠瓜品种的种子播种于营养盘内并置于温室中培养，待幼苗长至2片真叶时采集叶片供试。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及逆转录酶序列PCR扩增 采用改良CTAB法[8，24]提取瓠瓜基因组总DNA，用质量体积分数1.0%琼脂糖凝胶电泳及GENEQUANT纳米紫外分光光度计(德国Eppendorf公司)检测DNA浓度及纯度。

参照Hill等[21]的方法合成扩增LINE逆转座子RT序列所需的引物。上游引物LINE-F的序列为5′-GGGATCCNGGNCCNGAYGGNWT-3′，下游引物LINE-R的序列为5′-SWNARNGGRTCNCCYTG-3′，其中N为A/C/G/T，Y为C/T， W为A/T， S为C/G，R为A/G。PCR反应体系包含50 ng DNA、2.5 μL 10×Exbuffer(含MgCl2)、1.0 μmol·L-1上游和下游引物、0.20 mmol·L-1dNTPs、1 UExTaqDNA聚合酶，用灭菌双蒸水补足至25 μL。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后于72 ℃延伸10 min。用GeneAmp PCR System 9700型扩增仪(美国ABI公司)进行PCR扩增。扩增产物用质量体积分数1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用GeneGeniusBio Imaging System凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)观察和拍照。

1.2.2 PCR产物克隆及序列测定 回收纯化PCR产物，与pMD19-T Vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并培养过夜；用Amp抗生素与IPTG及底物X-gal进行蓝白斑筛选；挑取白斑，利用M13通用引物进行PCR扩增并鉴定出阳性克隆，送至广州英骏生物技术有限公司测序。

1.2.3 逆转录酶序列比对及系统进化树分析 利用NCBI VecScreen程序去除序列的载体部分，并用NCBI BLASTx程序同源比对推导获得RT片段序列及氨基酸序列；应用DNAStar软件进行序列长度、碱基组成、AT/GC比、氨基酸序列和多重比对等分析；结合GenBank报道的其他植物的RT序列构建系统进化树。

2 结果和分析

2.1 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的扩增与序列分析

利用简并引物从瓠瓜品种‘大籽葫芦’与‘杂交瓠瓜’的基因组总DNA中均获得长度约580 bp的特异片段(图1)，预期的片段长度与甜菜(BetavulgarisLinn.)[25]和牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)[26]的LINE逆转座子RT序列基本一致，说明该类逆转座子在瓠瓜中普遍存在。

将PCR产物回收克隆，随机挑取32个阳性克隆进行测序，去除1条重复序列。用NCBI BLASTx程序进行同源搜索，结果显示：有30条序列与已报道的其他种类的non-LTR逆转座子RT核苷酸序列具有较高的同源性，且均含有RT保守结构域，其中11条来自品种‘大籽葫芦’、19条来自品种‘杂交瓠瓜’。说明这些来源于瓠瓜的克隆均为LINE逆转座子RT序列，依次命名为LsRT1至LsRT30。

M: DL2000 DNA marker; 1: 品种‘大籽葫芦’ Cultivar ‘Dazihulu’; 2: 品种‘杂交瓠瓜’ Cultivar ‘Hybrid bottle gourd’.

图1 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的PCR扩增图谱

Fig. 1 PCR amplification pattern of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.

2.2 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的相似性分析

DNAStar软件分析结果表明(表1)：30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的长度并不完全一致，变化范围为564～599 bp，其中，LsRT10序列最长、LsRT2序列最短，其余序列长度为577～591 bp。碱基分析结果显示：30条RT核苷酸序列均富含碱基A和T，AT/GC比为1.29～1.76，A、T、G和C的数量分别为143～193、157～205、104～139和83～134。

30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的相似性为47.1%～99.5%(表2)，其中LsRT3与LsRT4的核苷酸序列相似性最高、LsRT10与LsRT26的核苷酸序列相似性最低(表2，图2)。由此可见，同一引物扩增所得的LINE逆转座子RT核苷酸序列并不一致，在序列长度、碱基组成及序列相似性等方面存在较大差异，反映出瓠瓜同一类群逆转座子的高度异质性。甜菜和牡丹等其他植物也有类似特点[25-26]。

2.3 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的系统进化分析

为阐明瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列间的相互关系，利用MegAlign程序对克隆获得的瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列构建系统进化树(图3)。根据核苷酸替代值，30条RT核苷酸序列可分为4个家族(Family 1、Family 2、Family 3和Family 4)，其中LsRT25核苷酸序列单独列为1个家族(Family 3)，与其他家族的遗传距离较远；Family 1、Family 2和Family 4分别包含14、8和7条序列，分别占序列总数的46.7%、26.7%和23.3%。Family 1包含的14条序列的相似性为55.2%～99.3%，其中仅LsRT2与LsRT10核苷酸序列长度差异较大，其余序列的长度均较一致，但存在由不同程度碱基替换、点突变与缺失突变导致的少许差异性(图2)；Family 1又可分为2个亚家族，分别包含9和5条RT核苷酸序列，其中LsRT12与LsRT22、LsRT13与LsRT21核苷酸序列的相似性最高，推测可能是在进化过程中由同一类逆转座子发生突变造成的。Family 2包含8个序列，相似性为58.5%～99.5%，该家族又可分为2个亚家族，分别包含7和1条RT核苷酸序列，其中LsRT3与LsRT4的核苷酸序列相似性最高，该家族序列间同样存在缺失突变、碱基替换与点突变(图2)。Family 4包含7条RT核苷酸序列，相似性为97.6%～99.3%，其中LsRT29与LsRT24的核苷酸序列相似性最高。由此可见，碱基替换、点突变或缺失插入突变可能是同一家族逆转座子异质性的原因之一。此外，不同家族包含的序列数量不同，也反映了其转座过程的差异性。

表1 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列的长度和组成比较

Table 1 Comparison on length and composition of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.

表2 瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列及氨基酸序列的相似性1)

Table 2 Similarity of RT nucleotide sequence and amino acid sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.1)

续表2 Table 2 (Continued)

1)横线下方的数值为核苷酸序列间的相似性，横线上方的数值为氨基酸序列间的相似性 Datums below the diagonal are similarity among nucleotide sequences and those above the diagonal are similarity among amino acid sequences.

2.4 瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列分析和相似性分析

利用NCBI BLASTx程序进行同源搜索，依据与瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列相似性较高的其他物种的RT氨基酸序列，对30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列进行推导翻译，其中LsRT11和LsRT28核苷酸序列从第2个核苷酸开始翻译，其他序列则从第3个核苷酸开始翻译。分析结果表明(图4)：瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列包含20个保守氨基酸残基，分别为第12(Phe)、第51(Lys)、第62(Arg)、第64(Ile)、第65(Ser)、第66(Leu)、第71(Tyr)、第72(Lys)、第82(Leu)、第94(Gln)、第96(Ala)、第97(Phe)、第101(Arg)、第103(Ile)、第105(Asp)、第112(Glu)、第124(Gly)、第132(Lys)、第133(Leu)和第147(Leu)位，推测这些位点可能是瓠瓜LINE逆转座子RT序列中非常保守的位点；另外还存在多个半保守氨基酸残基，如第78(Leu)、第81(Arg)、第83(Lys)、第134(Asp)和第137(Lys)位等。有14条序列存在终止密码子突变，其中LsRT25氨基酸序列存在3个终止密码子突变(第8、第93和第192位氨基酸)；LsRT11和LsRT28氨基酸序列存在2个终止密码子突变，前者为第18和第25位氨基酸，后者为第169和第171位氨基酸；存在1个终止密码子突变的氨基酸序列包括LsRT1(第158位氨基酸)、LsRT2(第158位氨基酸)、LsRT5(第24位氨基酸)、LsRT10(第139位氨基酸)、LsRT12(第137位氨基酸)、LsRT16(第137位氨基酸)、LsRT17(第137位氨基酸)、LsRT18(第16位氨基酸)、LsRT22(第139位氨基酸)、LsRT23(第158位氨基酸)和LsRT26(第147位氨基酸)；有16条氨基酸序列无终止密码子，但可能具有转录活性，包括LsRT3、LsRT4、LsRT6至LsRT9、LsRT13至LsRT15、LsRT19至LsRT21、LsRT24、LsRT27、LsRT29和LsRT30，占瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列数量的53.3%。因此，终止密码子突变可能是逆转座子发生突变与停止表达、进而导致逆转座子异质性的重要原因。

由表2还可以看出：经DNAStar软件MegAlign程序同源比对，30条瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列的相似性为26.7%～100.0%；其中，LsRT11与LsRT10氨基酸序列相似性最低，而二者核苷酸序列的相似性却达到47.5%；LsRT3与LsRT4、LsRT6与LsRT30、LsRT13与LsRT21、LsRT24与LsRT29的氨基酸序列相似性均为100.0%，其核苷酸序列相似性分别为99.5%、99.1%、99.3%和99.3%。结合图3可见，Family 1中LsRT12与LsRT22核苷酸序列的遗传距离最近、其相似性为99.3%，氨基酸序列的相似性为99.5%；Family 2中LsRT8与LsRT17核苷酸序列的遗传距离最近、其相似性为98.5%，氨基酸序列的相似性为97.4%；Family 4中LsRT5与LsRT27核苷酸序列的遗传距离最近、其相似性为98.1%，氨基酸序列的相似性为97.9%。瓠瓜LINE逆转座子RT序列各家族所包含的序列数目越多、相似性越高，表明发生转座的时间越近，具转座活性的可能性也越大。Family1、Family 2和Family 4分别包含8、3和5条无终止密码子的RT氨基酸序列，因此可能是具有转座活性的家族。

2.5 瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列的系统进化分析

将30条瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列与GenBank上登录的其他15种植物的LINE逆转座子RT氨基酸序列进行同源比对并构建系统进化树，结果见图5。瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列与葡萄(CAN76892)、拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.，AAB48348〕、黄瓜(CucumissativusLinn.，XP_004142331)等种类的LINE逆转座子RT氨基酸序列具有较高相似性，相似性为41%～59%。根据系统进化树，可将涉及的RT氨基酸序列聚为4组：LsRT1、LsRT2、LsRT5至LsRT7、LsRT9、LsRT10、LsRT12至LsRT15、LsRT18至LsRT25、LsRT27、LsRT29和LsRT30等22条氨基酸序列与黄瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列遗传距离较近，聚为第1组(Group Ⅰ)，该组包含的瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列数约占瓠瓜RT氨基酸序列总数的73.33%；第3组(Group Ⅲ)仅包含1条水稻(OryzasativaLinn.，EEE59033)LINE逆转座子RT序列；第4组(Group Ⅳ)仅包含二穗短柄草〔Brachypodiumdistachyon(Linn.) P. Beauv.，XP_003579203〕LINE逆转座子RT氨基酸序列，与其他组的遗传距离最远；LsRT3、LsRT4、LsRT8、LsRT11、LsRT16、LsRT17、LsRT26和LsRT28等8条氨基酸序列与其他12种植物的LINE逆转座子RT氨基酸序列聚为第2组(Group Ⅱ)，它们的进化关系相对较近。30条瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列主要集中在Group Ⅰ与Group Ⅱ中，说明瓠瓜LINE逆转座子RT序列兼具一定的保守性与较高的异质性。上述分析结果表明：不同植物种类间存在起源相同或相近的逆转座子；由于30条瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列相似性为26.7%～100.0%，因此不同种属间逆转座子的相似性可能比种属内更高。由此可见，瓠瓜与上述植物在进化过程中可能存在LINE逆转座子的横向传递现象。

3 讨 论

逆转座子广泛散布于植物基因组中，其具有的高异质性、高拷贝数及专一插入位点等特性对植物基因组结构大小与功能进化具有显著影响，对研究植物遗传多样性、遗传进化及基因克隆也具有重要意义[27]。瓠瓜种质资源的鉴定、评价及系统进化研究是加速品种改良和杂种优势利用的前提。作者利用LINE逆转座子RT序列简并引物从瓠瓜种质中扩增得到目的片段，扩增获得的30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列长度为564～599 bp，长度差为35 bp，其碱基组成与AT/GC比也存在较大差异。系统进化分析结果显示：30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列可划分为4个家族(family)，但4个家族的相似性变异范围较大，最小为1.7%，表现出很高的异质性。此外，终止密码子突变也普遍发生在瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列中，推测这是瓠瓜逆转座子高度异质性的主要原因之一，与牡丹和甜菜等作物逆转座子的丰富多态性及形成原因相似[26-27]。由于30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列为随机挑选克隆所得，目前尚未在30条RT序列中发现移码突变，而移码突变在许多物种的逆转座子RT序列普遍存在，因此，还需进一步研究瓠瓜RT序列中移码突变发生的可能性。以上分析结果表明：瓠瓜基因组的LINE逆转座子是一类较古老元件，其异质性是后来伴随寄主基因组的进化在转座与世代传递过程中逐渐积累突变的。

30条瓠瓜LINE逆转座子RT核苷酸序列分布于4个家族中，4个家族包含的RT核苷酸序列数量不同，表明其转录过程存在差异以及家族历史久远程度不同。进一步的研究结果显示：其中14条序列存在终止密码子突变，而另外16条可能具有转录活性的序列则分布于3个家族中，表明这些家族可能新近发生过转座整合事件，目前还具有转座活性[28]，可进一步用于瓠瓜种下变异的研究。Family 3仅包含1条RT核苷酸序列，与其他家族亲缘关系较远，表明该家族成员可能由其他家族成员突变而来或经横向传递进入瓠瓜基因组，因此相对较“年轻”；另外，鉴于克隆数目有限，也存在尚未分离其他成员的可能。植物体内的逆转座子易受到生物和非生物胁迫而激活其转录活性[29-33]，因此明确瓠瓜性状变异与逆转座子转录活性之间的关系，对于挖掘瓠瓜种质的优良基因具有重要意义。

逆转座子的纵向传递与横向传递是推测逆转座子起源、物种形成及其与物种相互关系的重要工具[34-35]。Voytas等[36]认为，植物逆转座子序列的种内异质性差异可能大于种属间。瓠瓜LINE逆转座子RT氨基酸序列的相似性为26.7%～100.0%，家族内部某些序列间的相似性极高，可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现；而与葡萄和拟南芥等种类LINE逆转座子RT氨基酸序列的相似性为41%～59%，说明瓠瓜LINE逆转座子虽较保守，但种内异质性差异高于种属间，可能是在进化历史上瓠瓜LINE逆转座子通过横向传递进入其他种类的基因组内，由此也可说明生物物种源于共同祖先。

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(责任编辑： 张明霞)

Cloning and characteristic analysis on RT sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria

ZHAO Qin①,②, XIE Dasen①, HE Xiaoming, LUO Shaobo, PENG Qingwu, CHEN Junqiu

(Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(1): 1-11

Taking cultivars ‘Dazihulu’ and ‘Hybrid bottle gourd’ ofLagenariasiceraria(Molina) Standl. as tested materials, RT sequence of LINE retrotransposon in their genomic total DNA was amplified, and alignment, homology analysis and phylogeny analysis of nucleotide sequence of 30 cloning products and their amino acid sequences encoded were carried out. The results show that genomic total DNA of both ‘Dazihulu’ and ‘Hybrid bottle gourd’ includes RT sequence fragment with length about 580 bp. Length of 30 RT nucleotide sequences (Nos. from LsRT1 to LsRT30) of LINE retrotransposon obtained from the two cultivars is 564-599 bp, base number of A, T, G and C is 143-193, 157-205, 104-139 and 83-134, respectively and AT/GC ratio is 1.29-1.76, which shows high heterogeneity. The main factors inducing difference in length of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariaare deletion mutation and stop codon mutation. Similarity of 30 RT nucleotide sequences of LINE retrotransposonfromL.sicerariais 47.1%-99.5%, and thatofaminoacidsequenceencodedis 26.7%-100.0%. Based on nucleotide substitution, 30 RT nucleotide sequences of LINE retrotransposon fromL.sicerariacan be divided into four families, which contains 14, 8, 1 and 7 sequences, respectively. The analysis result on amino acid sequence shows that RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariacontains 20 conservative amino acid residues and many semi-conservative amino acid residues, and 14 amino acid sequences possess stop codon mutation. Family 1, Family 2 and Family 4 may be the retrotransposon families with transposition activity, and include 8, 3 and 5 RT amino acid sequences without stop codon, respectively. According to phylogenetic tree constructed on RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariaand other 15 species, there is higher homology in RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariawith those fromVitisviniferaLinn.,CucumissativusLinn. and other species. It is suggested that LINE retrotransposon fromL.sicerariais a more ancient element, and can be horizontally transferred among genome ofL.sicerariaand other species.

Lagenariasiceraria(Molina) Standl.; LINE retrotransposon; RT sequence; sequence analysis; similarity; phylogeny

2014-06-24

国家自然科学基金资助项目(31311643); 广东省自然科学基金博士科研启动基金资助项目(10451064001006063); 广州市珠江科技新星专项资助项目(2013086)

赵 芹(1982—)，女，山东泰安人，博士，副研究员，主要从事瓜类遗传育种与分子生物技术方面的研究。

谢大森(1970—)，男，江西遂川人，博士，研究员，主要从事瓜类抗病育种与生物技术方面的研究。

Q785; S642.9

A

1674-7895(2015)01-0001-11

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.01.01

①并列第一作者

②通信作者 E-mail： zhaoqin0802@126.com