孕酮对大鼠脑损伤后脑水肿的影响及机制

魏山坡　李翀瑶　司道文

(保定市儿童医院,河北　保定　071000)



孕酮对大鼠脑损伤后脑水肿的影响及机制

魏山坡李翀瑶1司道文1

(保定市儿童医院,河北保定071000)

摘要〔〕目的观察孕酮对大鼠脑损伤(TBI)后脑水肿和前列腺素(PGE2)表达的影响。方法雄性老年SD大鼠48只随机分为假手术组、TBI组和孕酮治疗组，按照改良的Feeney自由落体损伤装置制作大鼠脑损伤模型。孕酮治疗组伤后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。各组于伤后24 h取材。用免疫组织化学法和免疫印迹法观察大鼠皮质PGE2的表达水平变化，并测量脑组织含水量。结果与假手术组大鼠相比，TBI组大鼠皮质PGE2表达和脑水肿较假手术组显著增加(P<0.05)；孕酮治疗组与TBI组比较，大鼠皮质PGE2表达和脑水肿明显减少(P<0.05)。结论孕酮可能通过降低PGE2的表达进而降低脑水肿，发挥TBI保护作用。

关键词〔〕孕酮；脑损伤；脑水肿；前列腺素

1华北理工大学基础医学院

第一作者：魏山坡(1977-),男,硕士，副主任医师，主要从事外科学研究。

脑损伤(TBI)目前尚无有效的治疗药物。近年发现孕酮(PROG)是一种非常具有潜力的脑保护药物，在不同的模型和种属以及不同的实验室，均得到了孕酮对脑损伤安全性和有效性的证据，其潜在治疗价值越来越受到认可〔1～7〕。两项Ⅱ期随机对照试验表明，孕酮用于治疗临床患者TBI可明显减少死亡率〔8,9〕。根据前期研究结果，美国国立卫生研究院赞助的孕酮治疗脑外伤的Ⅲ期临床实验(ProTECTⅢ:NCT00822900)正在进行，包括17个神经外科中心和预期1 000例患者，期待这些大样本多中心临床对照试验，在不久的将来能对孕酮治疗颅脑创伤的疗效及安全性作出科学评价〔10〕。目前对孕酮降低脑水肿的机制尚不明确。由于炎症反应在TBI后的继发性损伤中占有重要作用，是引起脑水肿的重要因素；而且炎症反应中环氧化酶(COX)-2的代谢产物前列腺素(PGE2)是重要的炎症因子。因此，本实验拟建立老年大鼠TBI模型，探讨孕酮降低脑水肿的机制。

1材料和方法

1.1材料健康雄性20月龄SD大鼠48只，体质量300 g(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)。将大鼠随机分为假手术组、TBI组和孕酮治疗组，每组16只，分别用于PGE2免疫组织化学检测和脑水肿测定。孕酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，兔抗人PGE2多克隆抗体(美国Cayman公司)，免疫组织化学试剂盒 (福州迈新生物)。

1.2动物模型采用Feeney自由落体硬脑膜外撞击方法建立模型。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，在矢状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处打开一直径5 mm骨窗，用40 g的击锤从25 cm处自由坠落冲击撞杆造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，开同样大小骨窗而不造成脑挫伤。孕酮治疗组伤后1、6 h腹腔注射孕酮16 mg/kg。假手术组和TBI组在相同时相腹腔注射等量生理盐水。

1.3脑组织含水量测定大鼠24 h断头后快速剥离全脑，距伤灶周围2 mm处取出脑组织，精密电子分析天平测其湿重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，取出后冷却10 min后称干重，按下面公式计算：脑含水量(%) =(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4免疫组织化学检测于伤后24 h，对大鼠脑组织取材固定，自视交叉后用恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚10 μm，贴附于载玻片上待用。免疫组化检测按照试剂盒说明进行操作。PBS代替一抗作阴性对照。阳性细胞为胞质和突起呈棕黄色。采用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数。切片在400倍光镜下观察，随机取5个视野，计数阳性细胞数，以平均值代表各区计数结果。

1.5Western 印迹检测伤后24 h，大鼠麻醉后取脑，分离伤灶周围皮层，置入细胞裂解液中，低温匀浆，离心15 min，取上清。蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液，95℃变性5 min。取20 μg样品在100 g/L SDS-PAGE上电泳后转至硝酸纤维素膜，以标准蛋白Marker为参照，加入兔抗人PGE2 mAb (1∶400)，4℃过夜，TBST冲洗后，加入二抗，DAB显色。以β-actin作为内参。蛋白条带扫描后，应用CMIAS真彩医学图像分析系统测定条带平均光密度值。

1.6统计学处理采用SPSS16.0软件行方差分析，两变量间关系分析采用线性相关分析。

2结果

2.1孕酮对大鼠TBI后脑水肿的影响与假手术组大鼠脑组织含水量〔(74.2±1.62)%〕比较，TBI组脑组织含水量明显增多(83.4±2.48)%(P<0.05)。孕酮治疗组脑组织含水量较TBI组显著减少〔(78.5±2.19)%,P<0.05〕。

2.2孕酮对大鼠TBI后皮层PGE2表达的影响免疫组化显示，假手术组大鼠皮质偶见PGE2表达(3.4±0.28)%。TBI组伤灶周围皮质可见大量PGE2阳性细胞的表达〔(46.2±2.76)%，P<0.05〕。孕酮治疗组脑损伤周围皮质PGE2阳性细胞显著减少(31.5±2.17)%(P<0.05)。进一步Western印迹检测显示，假手术组有少量PGE2蛋白表达(2.1±0.19)%。孕酮治疗组PGE2条带光密度值〔(12.8±1.86)%〕与TBI组〔(24.3±2.14)%〕比较，蛋白表达显著降低(P<0.05)。同时TBI后脑组织含水量与PGE2表达呈正相关(r=0.725,P<0.05)。

3讨论

TBI严重危害人类健康〔11〕，TBI后炎症反应在继发性损伤中具有重要作用。TBI后，通过胶质细胞增生，巨噬细胞和中性粒细胞浸润，激活释放细胞介质和炎性因子，从而诱发和加重血管源性和细胞毒性脑水肿。前期实验已经证实孕酮可以抑制TBI后炎性因子TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2的表达，减轻炎症反应过程〔12,13〕。本实验结果提示TBI后脑水肿的形成可能与PGE2有关；孕酮干预后，可明显减低脑组织含水量和PGE2，表明孕酮可能通过抑制PGE2的表达进而降低脑水肿，发挥脑保护作用。孕酮通过减轻脑水肿、保护血脑屏障、抑制脂质过氧化反应、减少自由基的产生、减轻钙超载、抑制兴奋性神经递质的释放、抑制炎症反应等多种生物学作用，发挥神经保护作用〔3〕。许多治疗脑外伤的药物在临床试验中被否定，或许因为这些药物仅作用TBI后的单一病理因素，因此不能获得良好的治疗功效；而孕酮能够阻止创伤后不同阶段的病理改变，保护神经元功能和促进DNA修复，具有多效性。而且，孕酮在脑内少突胶质细胞和神经元均可合成孕酮，孕酮还能保护发育的胎儿免遭氧化应激和免疫炎症的侵害，在神经元-胶质通讯和正常神经元发育中起关键性作用；因此可以设想孕酮在成人中枢神经元损伤修复中，许多过程实际重复了胚胎发育的关键步骤，这也从另一个角度提示孕酮具有脑保护作用〔1〕。本实验进一步证实了孕酮的脑保护功能。另外，孕酮有较宽的治疗窗，能够迅速通过血脑屏障，具有使用方便、安全、价格低廉等特点，使得孕酮在治疗TBI方面逐渐被认同，有可能成为非常具有潜力的治疗TBI的药物。

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〔2014-05-19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：司道文(1975-),男,硕士，副教授，主要从事人体解剖学研究。

基金项目：河北省教育厅科学研究计划项目(Z2011168);唐山市科学技术研究与发展计划项目(12140209A-55)；华北理工大学学生创新创业训练计划项目(X2015139)

中图分类号〔〕R742.7〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)21-6017-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.006