P2X3受体在糖尿病神经痛动物模型中的研究进展

魏骏骏，寿升芸，何晓芬，蒋永亮，方剑乔

(浙江中医药大学第三临床医学院，杭州　310053)



P2X3受体在糖尿病神经痛动物模型中的研究进展

魏骏骏，寿升芸，何晓芬，蒋永亮，方剑乔

(浙江中医药大学第三临床医学院，杭州310053)

【摘要】糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain，DNP)作为临床上最常见的并发症之一，极大地影响了患者的生活质量，目前发病机制尚不明确，缺少有效的治疗方法。DNP与周围感觉神经兴奋性增强有关，涉及多种离子通道、受体表达、功能上调，已有研究表明P2X3受体参与DNP等多种神经病理痛的痛觉形成、传导和调节，本文将围绕DNP模型的建立及P2X3受体在DNP模型中的作用予以综述。

【关键词】P2X3受体；糖尿病；神经痛；糖尿病神经痛

据WHO统计，全球目前共有3.47亿人患有糖尿病[1]，糖尿病已是继肿瘤、心脑血管疾病之后第三位威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖尿病神经痛(diabetic neuropathic pain, DNP)是糖尿病最常见的并发症之一，发病率高达32.7%[2]，严重影响患者生存质量。DNP与周围感觉神经兴奋性增强有关，涉及多种离子通道、受体表达、功能上调[3]。嘌呤受体P2X(purinergic P2X)家族是当前生物医学研究领域的一个热点。近年来研究表明P2X3受体参与包括DNP多种神经病理痛过程。本文将就P2X3受体在DNP模型中介导疼痛的研究进展予以综述。

1DNP动物模型

糖尿病神经痛的发病机制尚不明确，目前的治疗方案非常有限并且疗效欠佳。为了探讨DNP的发病机制以便于更好指导临床治疗，动物模型已成为研究该疾病重要手段。目前，国内外主要通过Alloxan注射法、STZ注射法、单独高脂高糖饮食法以及高脂高糖饮食联合小剂量STZ注射法建立DNP模型。DNP模型分为1型DNP模型(胰岛素依赖型)和2型DNP模型(非胰岛素依赖型)。

1.11型DNP动物模型建立及其病理变化

1.1.1Alloxan诱导模型

四氧嘧啶(alloxan，ALX)是一种核酸及其衍生物，其原理是选择性地损伤胰岛素β细胞，使β细胞分泌胰岛素的功能减弱，因此ALX诱导的动物糖尿病模型近似于人类的1型糖尿病。其造模方式一般为腹腔或尾静脉注射。

研究发现单次[4]注射ALX或多次[5]注射ALX，模型组分别于第8周、第6周痛阈下降；Jianbo L等[6]使用ALX发现2月后感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity，SNCV)降低，皆表示DNP模型造模成功。而杨明华等[7]使用尾静脉注射ALX，发现ALX诱导模型血糖波动起伏较大，会增加实验结果假阴性或假阳性的几率。同时，由于ALX对胰岛细胞有很强的选择性杀伤作用[8]，因此目前使用ALX制备的DNP模型较少。

1.1.2STZ诱导模型

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，其作用原理是通过破坏β细胞DNA从而使胰腺减少胰岛素分泌[9]。STZ诱导的糖尿病模型相对简单，通过腹腔或尾静脉一次性注射STZ即可。因此，STZ诱导的糖尿病大鼠模型广泛用于研究糖尿病神经病理痛的机制与治疗方法。

不同剂量的STZ引起胰腺中β细胞不同程度的损伤。文献中报道STZ注射量从35 mg/kg到200 mg/kg不等[10]。目前认为小剂量(40 mg/kg以下)STZ引发胰岛β细胞凋亡，大剂量(50 mg/kg以上)则引起胰岛β细胞坏死[11]。单用STZ注射的动物模型与人类1型糖尿病(胰岛素依赖性)相似。已有研究表明STZ注射72 h后，大多数大鼠出现高血糖，胰岛素分泌下降以及葡萄糖耐受下降[12]。研究发现STZ注射后4.5周，大鼠痛阈下降，DNP模型建立成功[13]。

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)具有多灶性轴突缺失的特征[14]。光镜观察1型DNP大鼠坐骨神经纤维排列异常，多处变性及断裂，有髓神经纤维密度分布不均匀且显著减少，髓鞘细胞肿胀坏死，有脱髓鞘现象[15]。这些形态学改变伴随着神经内膜微血管病变，血栓形成、血管周围基底膜增厚以及外周细胞退化。

1.22型DNP动物模型建立及其病理变化

1.2.1高脂饮食模型

在饮食引起的糖尿病模型中，大鼠或小鼠引起的糖尿病均与肥胖密切相关。因为营养过盛，其表现与人类代谢综合症相似。其中沙鼠、栉鼠、非洲刺毛鼠是其中2型糖尿病模型的常用鼠种[16]。C57BL/6 J小鼠只用简单的喂养高脂饮食(热量为45%～60%[17-18])即可，此型的特点为持续肥胖，胰岛素抵抗，高胰岛素血症及血清总胆固醇水平增高。嗜沙肥鼠需喂养高能量饮食[19]，此型的特点为食欲过盛，肥胖，葡萄糖耐受不良及高胰岛素血症，最终引起β细胞退化甚至坏死，胰岛素减少；缺点为过度的高热量饮食及酮症的产生而引起死亡。

饮食导致的糖尿病动物模型也用于研究糖尿病神经病理痛。已有研究表明，高脂饮食小鼠表现为神经传导速度降低，小感觉神经纤维神经病变[18]。这种方法主要局限于制备需要长期的喂养(16周[17]、34周[18])。

1.2.2高脂高糖饮食结合STZ诱导模型

用高脂高糖喂养结合STZ建立的实验性2型糖尿病大鼠模型，具有超重、糖耐量减退、血脂升高、血清胰岛素水平升高及胰岛素受体结合力降低的特点，与临床上2型糖尿病的特征十分相似。一般采用高热量饮食1个月可诱导出胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[11]。大量的文献表明高脂饮食联合运用STZ注射建立糖尿病模型的方法具有明显优势，通过这种方法，可以更快速地建立糖尿病模型。目前有许多高脂饮食和STZ剂量的联合方案。

研究发现使用高脂饮食结合低剂量STZ注射(30%、15 mg/kg)[20]，需大量时间才能建立糖尿病模型；而低热量饮食喂养及高剂量STZ注射(7%、65 mg/kg)，只需相对较少的时间[21]。Dang JK等[22]成功建立大鼠糖尿病模型后，于第2周检测机械痛阈及热痛阈皆下降，表明DNP模型成功；而胡明财等[23]以坐骨神经病变作为DNP模型成功标准。

文献报道STZ诱导的大鼠末梢轴突变性与人类DPN病变相符[24]。目前发现在STZ注射后不久，2型DNP模型在病理上表现为轴突萎缩，退化及缺失[24]；电镜下DPN组神经纤维髓鞘高度增厚，板层厚薄不一，呈波浪状或梅花状，毛细血管内皮肿胀增生[25]。但这些病理改变在所有模型中并不保持一致。

2P2X3受体在实验性DNP中的作用

2.1P2X3受体

P2X3受体为非选择性配体门控阳离子通道，在CCI(chronic constriction injury)[26]、炎性痛[27]等模型的痛信号生成、传播中起重要作用，已成为疼痛领域中新的研究方向。

P2X3受体主要分布于一些交感神经元、感觉神经元和孤束核[28]，以中、小型神经节细胞为主[29]，在细胞核上无明显表达，较少在大神经元与外周神经纤维上表达[30]。P2X3受体选择性表达于伤害感受器[31]，30%～40%P2X3受体表达于皮肤和内脏的DRG神经元，只有2%表达于骨骼肌的DRG神经元[32]。同时，P2X3受体也表达于中枢神经系统，特别是背外侧PAG[33]。文献报道P2X3受体与凝集素IB4、TRPV1、GDNF或SP等都有共同表达[34]，并且P2X3受体表达上调或者活性增强时疼痛加重，表达下降或者脱敏时疼痛会相应减轻[35]，证明它是进行性疼痛的重要受体。

已有研究发现P2X3受体在疼痛信号传导，调节神经元兴奋性，引起伤害感觉神经元病理痛[36]中起重要作用，P2X3受体能够与胞外ATP(一种主要的疼痛信号传送器[37])选择性结合[38]，被ATP激活后可允许Na+、K+、Ca2+离子通过[39]。研究证实组织损伤后ATP从多种细胞中释放，作用于临近细胞的嘌呤受体[40]。ATP诱发P2X3受体去极化[41]，感觉信息从外周传导到脊髓背角[42]。炎症或神经损伤时，P2X3受体对ATP或其激动剂α,β-methylene ATP (α,β-meATP)起反应，产生剧烈的疼痛反应行为[43]。P2X3受体在机体疼痛时显著表达于DRG神经元[3]，并选择性地表达于初级传入感觉神经元如三叉神经节(trigeminal ganglion)和结状神经节上[28]。研究证明在炎性或神经损伤的大鼠分离出的DRG神经元中，P2X3受体介导的ATP电流增强[44]。而敲除小鼠的P2X3受体后，小鼠丧失了对甲醛或ATP的疼痛反应，证明ATP激活P2X3受体参与组织的伤害性反应[45]。

2.2P2X3受体在DNP中的作用

糖尿病大鼠的外周信号传导通路包括ATP和嘌呤受体[3,46]。研究发现DNP模型中，P2X3受体在DRG神经元、脊髓背角和皮肤中都表达增多[47]。Xing J等[48]发现在STZ诱导的糖尿病模型中，PAG P2X3受体膜蛋白表达的下调可能损伤痛觉调控系统的下行抑制通路从而产生DNP。P2X3受体mRNA和蛋白水平在外周传入神经表达上调，并且P2X3受体拮抗剂抑制其机械痛超敏现象[3,46]。Xiao Z等[33]发现大鼠背外侧PAG显微镜下注射α,β-meATP后，对照组和STZ组机械痛皆上升，STZ组上升幅度、背外侧PAG上P2X3受体膜蛋白表达皆较对照组少，表明在PAG侧面注入α,β-meATP可引起镇痛效应。Migita K等[46]证明在DNP中，DRG神经元中P2X3受体mRNA表达上升，而P2X3受体抑制剂阻滞了STZ诱导模型的触觉痛，表明P2X3受体在DNP中起了关键作用。Shi L等[49]发现在大鼠DRG神经元P2X3受体总蛋白表达虽未改变，但膜蛋白表达显著增高，表明P2X3受体在糖尿病神经病变情况下从胞质向胞膜转移。虽然在糖尿病模型中，DRG神经元 P2X3受体转移机制仍不明确，但Xu GY[50]发现电刺激钙/钙调素依赖性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII, CaMKII)可促使P2X3受体膜蛋白的表达。以上研究表明P2X3受体在DNP中外周DRG神经元表达增加，发挥致痛效应；在中枢PAG表达却减少，起镇痛作用。

3总结

DNP模型的制备成功率取决于动物对STZ的敏感性[17]，因此制备DNP模型需根据动物种属、年龄、体重及成模时间等不同情况而定。P2X3受体在介导DNP中起着重要作用，进一步了解P2X3受体在DNP模型中发挥的作用与机制，有助于P2X3受体信号传导通路成为治疗DNP新的潜在靶点。

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〔修回日期〕2015-04-03

综述与专论

Progress of animal experimental research on P2X3

receptors in diabetes mellitus

WEI Jun-jun，SHOU Sheng-yun，HE Xiao-fen，JIANG Yong-liang，FANG Jian-qiao

(The Third Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

【Abstract】Diabetic neuropathic pain(DNP)is one of the most common complications in clinical, which influenced patients’ daily functions greatly, without clear mechanisms and effective methods. P2X3 receptors play a pivotal role in the formation, transmission and conduction of pain under neuropathic pain models, associated with peripheral sensory nerve excitability enhancement. This paper focuses on the establishment of DNP models, and the effects of P2X3 receptors in diabetes mellitus．

【Key words】P2X3 receptors；Diabetes；Neuropathic pain；Diabetic neuropathic pain

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.015

【中图分类号】R332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 05-0062-05

[通讯作者]方剑乔(1961-)，男，博士生导师，研究方向：针灸镇痛与免疫调节的相关性研究，E-mail： fangjianqiao7532@163.com。蒋永亮(1981-)，男，助理研究员、博士，研究方向：针灸镇痛与免疫调节的相关性研究，E-mail： jyl2182@126.com。

[作者简介]魏骏骏(1990-)，女，硕士生，研究方向：针灸镇痛与免疫调节的相关性研究，E-mail： 476275735@qq.com。

[基金项目]国家自然科学基金(81303039)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20133322120001)；浙江省博士后基金(BSH1302083)；浙江省高校重中之重一级学科(中医学)建设经费(浙教高科[2012]80号)。