结核病患者中性粒细胞L选择素的表达及意义

姜丽娜 姚春艳 金齐力 李柏青 (蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

结核病依然是全球重大卫生问题，控制乃至消灭结核是一项全世界肩负的艰巨任务〔1〕。在抵御结核感染的过程中，机体的免疫系统包括天然免疫和适应性免疫都担负着重要的职责。多形核细胞(PMN)或称中性粒细胞是天然免疫细胞之一，在结核感染的早期发挥着重要的作用〔2〕。L-选择素(CD62L)是近年来发现的细胞黏附分子选择素家族的成员之一，可以介导中性粒细胞的滚动〔3〕。本实验探讨CD62L在结核病发病机制中的作用，试图为结核病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 新鲜外周血标本来自结核病患者(均为蚌埠市传染病医院确诊病例，签署知情同意书)和正常人(均为我院健康教工和学生)。实验组:结核病患者32例，男19例，女13例，年龄22～67岁;对照组:正常人28例，男15例，女13例，年龄20～62岁。

1.2试剂 抗人CD62L-PE及同型对照鼠抗人IgG2a-PE购自eBioscience，RPMI1640培养液购自GIBCO公司，流式细胞仪，美国BD公司FACS Calibur。

1.3方法

1.3.1结核病患者PMN表面CD62L表达 取新鲜结核病患者抗凝全血放入流式管，30 μl/管，加入 CD62L-PE 3 μl避光孵育30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，弃去上清，加氯化铵3 ml避光放置15 min溶解红细胞，离心，弃上清，上流式细胞仪检测和分析。每个样本测定细胞数10 000个。

1.3.2结核分枝杆菌(M.tb)感染后PMN表面CD62L表达取新鲜结核病患者抗凝全血放入流式管，30 μl/管，加入制备好的 M.tb 悬液(浓度 5×108/ml)30 μl/管，混匀，37℃孵育30 min，再加入CD62L-PE，用流式细胞仪检测PMN表面CD62L表达率，同时正常人作对照，并计算M.tb感染前后CD62L表达变化率。M.tb感染后CD62L表达降低率=(感染前CD62L表达率－感染后CD62L表达率)/感染前CD62L表达率×100%。

1.4统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2结果

结核病患者和正常人PMN在M.tb感染前CD62L的表达率〔(87.12±14.73)%、(82.64±18.06)%〕均明显高于 M.tb 感染后 CD62L 表达率〔(9.22±5.95)%、(12.35±10.66)%〕(P＜0.05)，而结核病患者与正常人在M.tb感染前、后PMN表面CD62L表达率及降低率〔(89.26±6.61)%、(86.22±10.50)%〕无明显差异(P＞0.05)。

3讨论

机体感染结核分枝杆菌时，PMN最先聚集到炎症区域，发挥吞噬和杀伤功能，构成了宿主抵抗细菌感染的关键性机制，PMN的趋化作用是此过程的第一重要环节〔4～6〕。CD62L主要集中表达在PMN的微绒毛突起上，使得PMN与血管内皮细胞能够发生结合，进而有利于中性粒细胞的滚动、黏附。在细胞因子、炎症介质等刺激因素的作用下，PMN激活后，构象发生改变，CD62L迅速从PMN表面脱落，使PMN与内皮细胞之间的黏附作用降低，从而为PMN的游出提供了良好的前提条件〔7〕。有研究证明，CD62L缺陷型小鼠白细胞对炎症反应比野生型小鼠弱，且白细胞在血管外的移行距离远远小于野生型小鼠的移行距离〔8〕。Mulligan等〔9〕研究证明，应用 CD62L单克隆抗体能够阻断白细胞与内皮细胞上的黏附，而且能够阻止白细胞的渗出。这些资料都说明CD62L在介导白细胞的游出和与移行过程中发挥重要的作用。通常将PMN表面CD62L的表达下调看作是PMN活化的标志。那么，当机体遇到结核分枝杆菌刺激时，PMN被激活，从血管中游出到达感染区域而引起结核炎症反应，此过程中CD62L是否也发挥作用呢?

已有研究表明，PMN在小鼠气道感染结核分枝杆菌后，最先到达感染部位，在急性感染早期发挥重要的防御作用〔10〕。本实验结果表明，结核病患者既往感染过结核分枝杆菌，目前体内PMN处于未激活状态，因此PMN CD62L表达与正常人PMN CD62L表达基本无明显差别。PMN被结核分枝杆菌激活后，CD62L迅速从PMN表面脱落，表达下调。这一结果说明，结核分枝杆菌作为刺激因素导致PMN激活后，CD62L脱落，才使得PMN能够移行和游出。设想机体感染了结核分枝杆菌，在体内PMN就会被结核分枝杆菌刺激而发生活化，CD62L从PMN表面迅速脱落导致表达下调，这就有利于起始黏附的PMN与内皮细胞脱离，进而穿越和移行到达炎症反应区域，产生呼吸爆发和脱颗粒等效应杀伤结核分枝杆菌引起炎症反应。结核炎症的发生正是机体抗结核感染免疫功能的重要体现，适当的炎症反应可以消灭结核分枝杆菌，而过度的炎症反应则会引起细胞和组织的损伤。同时也发现在正常人体外PMN感染结核分枝杆菌时，PMN表面CD62L的表达也显著降低，说明正常人的PMN被结核分枝杆菌感染后也发生活化，CD62L脱落后导致表达下调。而正常人与结核病患者PMN CD62L在结核分枝杆菌刺激后表达降低的比率无明显差异。说明结核病患者PMN和正常人PMN同样在结核感染早期都会发挥抗结核感染免疫保护作用。

1 World Health Organization.Global tuberculosis report 2013〔R〕.World Health Organization Geneva，2013.

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6 Jaillon S，Galdiero MR，Del Prete D，et al.Neutrophils in innate and adaptive immunity〔J〕.Se min Immunopathol，2013;35(4):377-94.

7 Rogowski O，Sasson Y，Kassirer M，et al.Down-regulation of the CD62L antigen as a possible mechanism for neutrophilia during inflammation〔J〕.Br J Haematol，1998;101(4):666-9.

8 Hickey MJ，Forster M，Mitchell D，et al.L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo〔J〕.J Immunol，2000;165(12):7164-70.

9 Mulligan MS，Miyasaka M，Tamatani T，et al.Requirements for L-selectin in neutrophil-mediated lung injury in rats〔J〕.J Immunol，1994;152(3):832-40.

10 Seiler P，Aichele P，Bandermann S，et al.Early granuloma formation after aerosol mycobacterium tuberculosis infection is regulated by neutrophils via CXCR3-signaling chemokines〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(10):2676-86.