腹主动脉瘤患者外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞功能变化

屈碧辉 蔡 威 何 涛 胡 敏 王迪乐 (武汉市中心医院血管外科，湖北 武汉 43004)

腹主动脉瘤(AAA)是一种常见的炎性血管疾病〔1〕。AAA炎症的特点是主动脉壁多种白细胞的浸润，包括淋巴细胞〔2〕。文献报道干扰素(IFN)-γ在AAA患者血液和肿瘤组织中的表达均出现显著的增加〔3～5〕。同时，CD4 T细胞和IFN-γ与 AAA的发生发展密切相关〔6〕。这些研究表明，AAA患者的免疫处功能是处于失衡状态的，据此导致CD4 T细胞的异常增殖和分泌更多的IFN-γ，从而导致腹主动脉扩张相关的自身免疫损伤过程。调节性细胞在维持机体免疫状态平衡中具有重要的作用。除外常见的CD4调节性T细胞(Treg)外，还有一群B细胞，主要细胞表型为CD19+CD24hiCD38hiB细胞，也具有抑制CD4 T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力，CD19+CD24hiCD38hiB的这种免疫抑制功能主要是通过分泌均细胞介素(IL)-10而实现的〔7〕。CD19+CD24hiCD38hiB细胞的免疫调节功能异常在其他疾病中已有报道〔8〕，而关于 CD19+CD24hiCD38hiB细胞在AAA发病中的作用还未见文献报道。本研究观察了AAA患者外周血 CD4 T细胞及CD19+CD24hiCD38hiB调节性 B细胞(Breg)比例及功能的变化情况，期望为AAA发病机制研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1临床资料 收集2012年5月至2014年8月择期手术的AAA患者40例及同期入院进行健康体检者40例。AAA组患者中，男33 例，女 7 例，平均年龄(59.65±8.28)岁，排除自身免疫性疾病、严重心肝肾功能不全和血液系统疾病等。所有患者均经CT或磁共振成像(MRI)检查确诊为AAA。健康对照组中，男32 例，女8 例，平均年龄(59.78±9.49)岁。

1.2外周血单个核细胞(PBMC)分离方法 静脉取血，加入含肝素溶液的试管中，混匀，使血液抗凝。抗凝血以无菌RPMI 1640培养基按1∶1的比例进行稀释，按稀释血液和淋巴细胞分离液2∶1的比例，将预加淋巴细胞分离液离心管倾斜45°角，用滴管将稀释的血液缓缓沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰，800 r/min离心18 min;滴管轻轻吸取中间的白膜层，加入装有RPMI 1640培养基的移入另一支离心管中，600 r/min离心15 min;细胞沉淀以适量 RPMI 1640培养基重悬，400 r/min离心8 min;台盼蓝染色计数后制备成合适浓度的细胞悬液用于后续实验。

1.3表面分子流式细胞染色 上述分离获取的PBMC以流式细胞染色洗液洗涤2次后，加入CD4、CD19、CD24和CD38荧光抗体，4℃冰箱中孵育30 min;以流式细胞染色洗液洗涤2次后，细胞重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中立即进行流式细胞仪检测。

1.4胞内分子流式细胞染色 上述分离获取的PBMC中加入Activation Cocktail(含有高尔基体阻断剂)，于37℃，5%CO2培养箱中孵育6 h;收集细胞，按上述方法进行表面分子CD4流式细胞染色，随后加入0.5 ml细胞膜固定透化液，室温避光孵育30 min;以透化液洗涤细胞2次后加入IFN-γ抗体，室温避光孵育30 min;以透化液洗涤细胞2次，细胞重悬于0.2 ml PBS中立即进行流式细胞仪检测。CD19+CD24hiCD38hiB细胞抑制CD4 T细胞IFN-γ分泌能力检测时，将两种细胞按1∶1比例加入于1 μg/ml CD3抗体及2 μg/ml CD28抗体包被的96孔板中，于37℃，5%CO2培养箱中共孵育72 h，随后按上述步骤进行检测。

1.5CFSE细胞增殖检测 上述分离获取的PBMC经磁珠分选(按说明书进行操作)获取Naïve CD4 T及经流式细胞仪分选获取CD19+CD24hiCD38hiB细胞。Naïve CD4 T以10 ml的 RPMI 1640培养基洗涤1次，以1 ml的RPMI-1640重悬，按10 μl/1×107个细胞加入CFSE染液，混匀后于37℃，5%CO2培养箱中避光孵育15 min，随后立即在细胞中加入5 ml预冷的含5%PBS的RPMI 1640培养基进行终止染色，随后冰上放置5 min，离心8 min，再以10 ml的RPMI 1640培养基洗涤1次，细胞以含10%FBS的 RPMI-1640完全培养基重悬后，加入1 μg/ml CD3抗体及2 μg/ml CD 28抗体包被的96孔板中，孵育5 d后收取细胞进行流式细胞仪检测。CD19+CD24hiCD38hiB细胞抑制Naïve CD4 T细胞增殖能力检测时，将两种细胞按1∶1比例加入于1 μg/ml CD3抗体及2 μg/ml CD28抗体包被的96孔板中，于37℃，5%CO2培养箱中共孵育5 d，随后按上述步骤进行检测。

1.6统计学处理 采用GraphPad软件进行t检验。

2结果

2.1外周血CD4 T细胞比例变化情况 AAA患者外周血CD4 T细胞比例〔(56.9±5.9)%〕高于健康对照外周血 CD4 T细胞比例(44.6±6.2)%(P＜0.05)。

2.2CD4 T细胞IFN-γ分泌情况 AAA患者外周血IFN-γ+CD4 T 细胞比例〔(46.5±5.28)%〕(P＜0.05)。

2.3CD19+CD24hiCD38hiB细胞比例变化情况 AAA患者外周血 CD19+CD24hiCD38hiB 细胞比例为(1.01±0.13)%，健康对照组外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞比例为(1.17±0.14)%，二者相比差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

2.4CD19+CD24hiCD38hiB细胞抑制CD4 T细胞增殖能力检测健康对照外周血单独Naïve CD4 T细胞的增殖能力为(84.9±5.12)%，Naïve CD4 T 细胞与 CD19+CD24hiCD38hiB 细胞共培养后，Naïve CD4 T 细胞的增殖能力为(51.8±3.99)%，提示，健康对照外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞可显著抑制外周血Naïve CD4 T细胞的增殖能力(P＜0.01);AAA 患者外周血单独Naïve CD4 T 细胞的增殖能力为(86.5±4.94)%，Naïve CD4 T细胞与CD19+CD24hiCD38hiB细胞共培养后，Naïve CD4 T细胞的增殖能力为(80.6±5.83)%，提示，AAA患者外周血 CD19+CD24hiCD38hiB细胞抑制外周血Naïve CD4 T细胞增殖的能力显著降低(P＞0.05)。

2.5CD19+CD24hiCD38hiB细胞抑制CD4 T细胞IFN-γ分泌能力检测 健康对照患者外周血IFN-γ+CD4 T细胞比例在与CD19+CD24hiCD38hiB细胞共孵育后从(24.9±5.02)%下降至(8.89±3.03)%(P＜0.01)。

3讨论

AAA是指腹主动脉呈瘤样扩张，通常直径增大50%以上定义为动脉瘤。AAA的发病机制涉及环境、遗传、生物化学等多种因素。慢性炎症细胞浸润是AAA的典型特征。Xiong等〔6〕证实，CD4缺陷小鼠可抵抗AAA的形成提示CD4 T细胞可促进AAA的发生和发展。CD4 T可分泌大量的炎性细胞因子，如 IFN-γ 和 TNF-α〔9～12〕。文献报道，IFN-γ 在 AAA 患者血液和肿瘤组织中的表达均出现显著的增加〔3～5〕，提示CD4 T细胞及其IFN-γ分泌能力的异常可能会导致AAA的发生和发展。结合文献报道结果，提示比例异常升高的CD4 T细胞可分泌大量的IFN-γ，从而参与AAA的发病。

目前，CD4 Treg细胞在AAA形成中的作用已得到肯定。而关于CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞在AAA发病中的作用还未见文献报道。因此，根据CD4 Treg在AAA中功能是存在异常的，可推论CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞功能在AAA亦可能存在异常，这两种调节性细胞功能的异常均参与了CD4 T细胞功能异常的调控，最终导致腹主动脉扩张相关的自身免疫损伤过程。本研究提示，CD19+CD24hiCD38hiB细胞功能的异常参与了AAA的发生和发展。为AAA发病机制的研究提供了一定的科学依据。

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