尿足细胞标志蛋白podocalyxin在肾病综合征合并急性肾损伤诊断中的价值
2015-01-25王福珍丘昭文朱杰吴森超林冲云王朝晖
王福珍,丘昭文,朱杰,吴森超,林冲云,王朝晖
(1.福建医科大学附属龙岩市第一医院肾内科,福建 龙岩 364000;2.上海师范大学数理学院,上海 200234;3.上海交通大学医学院附属瑞金医院肾内科,上海 200025)
·临床论著·
尿足细胞标志蛋白podocalyxin在肾病综合征合并急性肾损伤诊断中的价值
王福珍1,丘昭文1,朱杰2,吴森超1,林冲云1,王朝晖3
(1.福建医科大学附属龙岩市第一医院肾内科,福建 龙岩 364000;2.上海师范大学数理学院,上海 200234;3.上海交通大学医学院附属瑞金医院肾内科,上海 200025)
目的探讨原发性肾病综合征(PNS)患者尿液中podocalyxin(PCX)的变化对急性肾损伤(AKI)的诊断价值。方法对PNS合AKI患者(n=33例,AKI组)和未合并AKI患者(n=24例,非AKI组)尿液PCX、血清半胱氨酸蛋白酶抑制物C(Cystatin C,Cys C)、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血浆清蛋白(ALB)水平进行检测,观察上述指标与病情关系。结果AKI组尿PCX(42.04±11.01)ng/ml显著高于非AKI组(30.88±9.93)ng/ml;血清Cys C水平(1.91±0.54)mg/L显著高于非AKI组(1.29±0.34)mg/L,而血清LDL-C和血浆ALB水平在两组中比较差异无统计学意义。随着AKI病情加重,估算的肾小球滤过率(eGFR)的减少,尿PCX、血清Cys C增加更为明显。结论联合检测原发性肾病综合征患者尿PCX、血清Cys C有助于AKI的诊断及病情判断。
尿液;podocalyxin;肾病综合征;急性肾损伤
原发肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)常合并急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)。AKI会加重患者病情,增加治疗难度和病死率。它可发生于PNS病程中的任何阶段。若能及时诊断,合理治疗,大部分患者肾功能可好转,预后较好,但也有少数病例发展为慢性肾衰竭,需要终生替代治疗。因此,探索PNS合并AKI的早期诊断生物学标志物是临床研究的重要问题。PNS常常伴有足细胞的病变,因此,我们试图通过检测PNS患者尿液中足细胞标志蛋白之一podocalyxin的水平来分析其与PNS合并AKI之间的关系。
1 资料与方法
1.1一般资料
选择2011年1月-2013年3月福建医科大学附属龙岩市第一医院肾内科住院的PNS患者。其中,男32例,女25例;年龄20~65岁,平均(30.5± 8.5)岁。本研究经医院伦理委员会批准,参加者均签署知情同意书。自PNS发病(或复发)至入院时间为3~30 d,其中,33例合并急性肾损伤,24例肾功能正常作为对照组。所有病例均符合以下标准:①24 h尿蛋白定量>3.5 g/d,血浆白蛋白<30 g/L,伴或不伴水肿,高脂血症;②排除继发性肾病综合征(如狼疮性肾炎、乙型肝炎病毒相关性肾炎、过敏性紫癜性肾炎、肾淀粉样变和糖尿病肾病等继发性肾脏病变);③所有病例均进行了肾活组织病理检查。
1.2AKI的诊断
按2012年KDIGO指南的诊断和分期标准,即48 h内血肌酐上升≥0.3 mg/L或较原先水平增高50%;和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)持续6 h以上(排除梗阻性肾病或脱水状态);并分为1~3期。1期为清肌酐升高达基础值的1.5~1.9倍,或升高值≥26.5μmol/L(0.3 mg/dl),和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)持续6~12 h;2期为血清肌酐升高达基础值的2.0~2.9倍,和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)持续12 h以上;3期为血清肌酐升高达基础值的3.0倍,或血肌酐升高至≥353.6 umol/L,开始肾脏替代治疗,和(或)尿量<0.3 ml/(kg·h)持续24 h以上,或者无尿持续12 h及以上。
1.3研究方法
1.3.1分组方法每个研究对象入院时立即留取1次血液及尿液标本,入院时合并AKI患者以入院时肾功能所处分期列入相应分组,住院期间肾功能正常者列为对照组(非AKI组),住院期间出现急性肾损伤者列入肾损伤组(AKI组)。
1.3.2标本采集所有受试者取空腹静脉血10 ml,采用西门子全自动生化分析仪测定血清肌酐、血清Cys C、血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和血浆清蛋白(ALB)。留取24 h尿,记录尿量后从中取出10 ml尿标本,尿蛋白定量采用邻苯三酚红比色测定法。
1.3.3尿podocalyxin的检测采用CUSABIO有限公司生产的酶联免疫试剂盒检测尿PCX。具体操作步骤如下:留取肾病患者清洁中段晨尿10 ml,用无菌管收集尿液于2~8℃1 000×g离心15 min取上清用于实验。分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μl,轻轻晃动混匀,覆上板贴,37℃温育2 h。弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl,覆上新的板贴,37℃温育1 h。弃去孔内液体,甩干,洗板3次。每次浸泡2 min,200μl/每孔,甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl,覆上新的板贴,37℃温育1 h。弃去孔内液体,甩干,洗板5次。每次浸泡2 min,200μl/每孔,甩干。依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色15~30 min。依序每孔加终止溶液50μl,终止反应。在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
数据处理将标准品及样本值减去SO孔数值后绘制曲线,以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标),OD值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线。根据样本OD值,由标准曲线查出相应的浓度。
1.3.4eGFR的计算采用针对中国慢性肾脏病患者改良的简化MDRD公式来评算肾小球滤过率[1],即eGFR(ml/min/1.73 m2)=175×[Scr(mg/dl)]-1.234×年龄-0.179×(女性×0.79)
1.4统计学方法
2 结果
2.1肾病综合征合并与不合并急性肾损伤患者的各项临床指标比较
与非AKI组相比较,AKI组患者尿PCX、血Cys C、血肌酐、血尿酸和血纤维蛋白原的水平明显升高(均P<0.001),eGFR值显著下降(P<0.001)。AKI组患者使用利尿剂人数高于非AKI组(P<0.001)。AKI组患者收缩压高于非AKI组(P<0.001),舒张压两组差异无统计学意义。其他指标如年龄、病程、尿蛋白定量、血总胆固醇、血低密度脂蛋白胆固醇和血纤维蛋白原等,两组比较差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。
表1 两组患者的基线情况比较(±s)
组别年龄/岁月使用利尿剂/%收缩压/mmHg舒张压/mmHg尿蛋白定量/(g/24 h)血浆清蛋白/(g/L)AKI组(n=33)31.2±7.929/143.21±2.2248.48%137±2184±135.22±2.0718.83±3.66非AKI组(n=24)33.1±9.224/103.58±1.6420.83%125±1982±115.55±2.5719.56±4.97 P值0.3350.297<0.001<0.0010.1130.2850.166男/女病程/组别血总胆固醇/ mmol/L血低密度脂蛋白胆固醇/(mmol/L)纤维蛋白原/(g/L)血尿酸/(μmol/L)血肌酐/(μmol/L)血Cys C/(mg/L)eGFR/[ml/(min·1.73 m2)]尿PCX/(ng/ml)AKI组(n=33)8.85±3.126.67±2.656.87±1.74498.36±175.73 194.38±31.011.91±0.5421.33±8.8542.04±11.01非AKI组(n=24)9.21±2.647.80±2.994.59±1.57396.57±165.7874.38±9.521.29±0.3484.07±10.5130.88±9.93 P值0.0970.102<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001
2.2各项指标与急性肾损伤严重程度相关性分析
随着急性肾损伤病情加重,尿PCX、血Cys C和血肌酐逐渐升高(P<0.05),尿PCX、血Cys C和血肌酐随着eGFR的减少呈负相关(其中,尿PCXr= -0.553,P<0.001;血Cys Cr=-0.78,P<0.001;血肌酐r=-0.867,P<0.001)。见图1~3。
2.3各项指标与急性肾损伤严重程度(AKI分期)单因素方差分析
把33例合并急性肾损伤患者,根据KDIGO关于AKI指南的诊断和分期标准分为AKI1期、2期和3期,比较各期患者尿PCX、血Cys C和血肌酐值的差异性。结果表明急性肾损伤肾功能受损程度越高,患者尿PCX、血CysC和血肌酐值的水平也越高,各期比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。
进一步两两比较发现,AKI 3期与1期比较差异有统计学意义(P=0.001)、AKI 3期与2期差异有统计学意义(P=0.009),但AKI 2期与1期之间差异无统计学意义(P=0.063);Cys C指标AKI各期之间差异有统计学意义(P=0.001),进一步两两比较发现,AKI 1期与3期差异有统计学意义(P= 0.001),但AKI 2期与1期(P=0.090)、AKI 3期与2期之间差异无统计学意义(P=0.136)。
表2 合并急性肾损伤患者肾功能状况与各指标之间的关系(±s)
注:1)与1期比较,P<0.05,2)与2期比较,P<0.05
AKI分期血肌酐/(μmol/L)1期(n=14)185.59±28.372)2期(n=10)278.53±43.151)3期(n=9)366.37±34.241)2)尿PCX/(ng/ml)血Cys C/(mg/L)34.5±7.922)1.58±0.422)42.11±6.601)1.94±0.351)53.68±9.041)2)2.38±0.551)2)
3 讨论
AKI是原发性肾病综合征的常见并发症之一。长期以来血肌酐、尿素氮一直是作为反映肾损伤最主要的生物标志物,但上述两项具有局限性,主要原因:血肌酐和尿素氮的水平升高常发生于肾损伤后数天至数周,无法监测肾脏的早期病变;血肌酐和尿素氮的血液蓄积只与肾小球滤过率下降相关,并不能反映肾小管的损伤、坏死;血肌酐和尿素氮水平变化容易受年龄、性别、种族、饮食、身体状况及药物等多因素的影响,不能真实反映早期肾功能受损情况[2-3]。所以,倘若单纯依靠血肌酐、尿素氮的检测可能延误AKI的早期诊断及治疗。
足细胞位于肾小球毛细血管壁最外层,以其次级突起即足突和基底膜相连,足突间有裂隙隔,其上覆盖的裂隙隔膜是构成肾小球血液滤过屏障的主要成分。足细胞受损后从肾小球基底膜脱落破坏滤过膜的完整性,是蛋白尿发生的病理基础之一。足细胞的破坏反映了肾小球的损害程度[4-5]。足细胞的足突和裂隙隔膜的多个蛋白分子逐渐被认识,PCX是足细胞表达的一种特异蛋白分子,其正常表达能防止带负电荷的蛋白分子漏人原尿中。VITUREIRA等认为尿液PCX可监测肾小球损伤的活动性,认为尿沉渣PCX水平是评估急性肾小球损伤的严重性的可靠实验室指标[6]。有研究表明糖尿病患者尿PCX水平较健康人组明显增高,且随着病情加重,糖尿病病程的延长,其尿PCX水平出现明显的增加[7]。亦有研究表明,IgA肾病病程中尿足细胞阳性预示病情进展,而阴性则标志着病情稳定或缓解[8]。本研究证实原发性肾病综合征合并AKI患者,尿中可以检测到尿足细胞标志蛋白PCX。在PNS合并AKI组中尿PCX较对照组明显增高,说明尿足细胞标志蛋白是AKI的良好标志物。为了观察急性肾损伤的严重程度与尿足细胞标志蛋白是否有相关性,本研究设置了AKI不同分期组比较观察尿足细胞标志蛋白,研究显示随着急性肾损伤程度的逐渐加重,尿PCX浓度逐渐升高,在急性肾损伤3期与1、2期差异有显著性,但1期与2期差异无显著,提示尿足细胞标志蛋白对AKI严重程度及预后评估有重要作用。尿PCX为无创性检查,且简单、快捷。
1983年ANASTASI等首次在鸡蛋清中分离到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor,CPI),之后被命名为胱抑素C。它能在几乎所有的有核细胞内以恒定的速度持续地转录与表达,无组织学特异性,故在体内以恒定速度产生[9]。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代谢分解,不返回血液,因此,其血中浓度由肾小球滤过决定,而不依赖任何外来因素,如性别、年龄、饮食的影响,是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。目前大量研究资料已显示,Cys C比BUN、血Cr具有更高的敏感性和特异性,在评价肾小球滤过率中具有重要的价值,已被公认为是肾功能早期损伤的标志物之一。本研究显示在PNS合并急性肾损伤时血Cys C明显升高,AKI组和对照组有显著性差异。同时本研究观察在AKI不同分期中的血Cys C水平,显示AKI1期与AKI3期有显著差异,但相邻两期差异无显著,随着急性肾损伤病程进展,血Cys C水平呈现逐渐升高趋势。血中Cys C对PNS合并AKI的诊断及病情观察具有重要的临床意义
理论上PNS患者ALB越低,血管内有效血容量相对不足,肾间质水肿越明显,加重肾损伤。近年来对于高脂加重肾小球进行性硬化的作用十分受重视。本研究同时观察血LDL-C、ALB水平与急性肾损伤的关系,发现上述指标在急性肾损伤组与对照组之间,及急性肾损伤各期间无显著差异。本研究提示PNS中血脂与血白蛋白的水平与AKI无相关性。
本组病例分析中还可观察到利尿剂的不适当使用可能是导致急性肾损伤的一个原因。由于肾病综合征患者因低蛋白血症往往肾脏有效血容量不足,此时若不适当地过度利尿,将导致肾脏血流灌注明显减少,从而影响肾小球滤过率,促进急性肾损伤的发生。
综上所述。在PNS患者中,联合检测尿PCX和血清胱抑素可以为PNS合并AKI的防治提供依据。通过本实验研究结果表明,对PNS患者检测尿PCX、血Cys C有助于及早发现AKI,并反映AKI病情严重程度。上述两项检测指标具有无创、可操作性强、敏感等特点,有助于了解PNS合并AKI的发病机制,也为临床预测PNS中AKI提供新的检测指标。
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Urinary podocalyxin as a marker of primary nephrotic syndrome complicated with acute kidney injury
Fu-zhen WANG1,Zhao-wen QIU1,Jie ZHU2,Sen-chao WU1,Chong-yun LIN1,Chao-hui WANG3
(1.Department of Nephrology,the First Hospital of Lonyan,Fujian Medical University,Longyan, Fujian 364000,P.R.China;2.Mathematics and Science College,Shanghai Normal University, Shanghai 200234,P.R.China;3.Department of Nephrology,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,P.R.China)
【Objective】To explore the diagnostic value of acute kidney injury(AKI)in the changes of primary nephrotic syndrome(PNS)patient's urine podocalyxin(PCX).【Methods】The concentration of urine PCX and serum CystatinC(CysC)and serum low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)and albumin(ALB)is detected in the group of PNS with AKI(n=33 cases)and the group of PNS without AKI(n=24 cases).Then we observe the relation between the index above-mentioned and the patient's condition.【Results】The urine PCX and serum CysC in the group of PNS with AKI are significant higher than the group of PNS without AKI.There is no significant difference of the serum LDL and ALB in the two groups.As the patient's condition become more serious and the estimation glomerular filtration rate(eGFR)become fewer,the increasing of urine PCX and serum CysC is more evident.【Conclusions】The conjoined detection of urine podocalyxin and serum CysC in the PNS patients is beneficial to early diagnosis and judgment of patient's condition of AKI.
urine;podocalyxin;nephrotic syndrome;acute kidney injury ?
R692
A
1005-8982(2015)28-0036-05
2015-06-03
林冲云,E-mail:lingchongyun@163.com