IL-10基因启动子区域遗传多态性研究*

王海彦，韦叶生，黄孔文，廖品琥，熊滨，李军，黄冰，胡东海，仇晓文

（1.右江民族医学院附属医院重症医学科，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院检验科，广西 百色 533000；3.广西壮族自治区人民医院重症医学科，广西 南宁 530021；4.广西医科大学肿瘤医院麻醉科，广西 南宁 530021）

·论著·

IL-10基因启动子区域遗传多态性研究*

王海彦1，韦叶生2，黄孔文1，廖品琥1，熊滨3，李军1，黄冰4，胡东海1，仇晓文1

（1.右江民族医学院附属医院重症医学科，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院检验科，广西 百色 533000；3.广西壮族自治区人民医院重症医学科，广西 南宁 530021；4.广西医科大学肿瘤医院麻醉科，广西 南宁 530021）

目的比较分析IL-10基因启动子区域SNP等位基因和基因型在不同地区、种族之间的分布。方法使用PCR和DNA测序方法，检测广西地区人群IL-10基因启动子区域rs1800871G/A、rs1800872G/T多态性，并与人类基因组计划研究的4个人群（欧洲、中国北京、日本及非洲）以及新西兰、丹麦及墨西哥等地区人群SNP分型数据相比较。结果rs1800871G/A、rs1800872G/T SNP的分型数据，在男性、女性组间分布差异无统计学意义（P＞0.05）。其SNP分型数据与中国北京地区、日本人群相比较，分布差异无统计学意义（P＞0.05）；而与非洲、欧洲、墨西哥、丹麦及新西兰地区人群比较，分布差异有统计学意义（P＜0.01）。结论IL-10基因启动子区域rs1800871G/A、rs1800872G/T多态性在不同地区、种族人群之间的分布有差异。

IL-10；多态性；基因型

白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）是一种具有多效应功能的细胞因子，主要由T细胞亚群Th2细胞、巨噬细胞及单核细胞等合成、释放，其通过免疫抑制及免疫刺激双重作用，调节机体的炎症反应与免疫反应平衡，维持机体内环境稳态[1-4]。人类IL-10的基因定位于染色体1q32，其基因启动子区域单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）影响血清IL-10的表达水平[5-6]。目前研究显示，IL-10基因SNP与多种炎症性疾病有关，如脓毒症[7]、哮喘[8]及强直性脊椎炎[9]等。到目前为止，国内外对IL-10基因单核苷酸多态性的研究主要聚焦在其与疾病的联系上，而对其地区分布及种族人群的研究较少。本研究检测IL-10基因启动子区域SNP位点中的2个位点，以分析其基因型和等位基因频率在广西地区人群中的分布，并与人类基因组计划研究的4个人群（欧洲、非洲、中国北京及日本）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）以及墨西哥、丹麦及新西兰等地区人群SNP分型结果相比较，探讨IL-10基因启动子区域SNP在不同地区、种族人群之间的分布差异。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取199例广西地区中临床指标和实验室检查均在正常范围内的健康体检者。其中，男118例，女81例；平均（54.0±14.61）岁。确认无器质性疾病，且无血缘关系。每位参与者对本试验项目知情同意，并自愿参与。

1.2主要试剂

全血DNA提取盒（天根生化科技有限公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），虾碱酶（Promega），外切酶Ⅰ（Epicentre），Hotstar Taq聚合酶（Qiagen），延伸反应试剂盒（SNaPshot Multiplex kit，ABI）。

1.3方法

1.3.1标本制备EDTA-K3抗凝采血管收集每位参与对象外周静脉血2 ml，提取全血DNA，-70℃保存备用。

1.3.2多态性位点基因型的分析采用本实验室常用的单碱基延伸PCR分析方法检测IL-10基因启动子区域rs1800871G/A、rs1800872G/T基因型。PCR引物通过在线Primer3软件设计（http://frodo. wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）。其中，rs1800871 G/A位点引物序列上正向为：5'-TCCCAA GCAGCCCTTCCATT-3'，反向：5'-CCAAATTCTCAGT TGGCACTGG-3′，扩增片段长度322 bp；延伸引物序列为：5'-TTTTTTTTTTTTTTCACTGGTGTACCCTT GTACAGGTGATGTAA-3'。rs1800872 G/T位点引物序列正向为：5'-TCCCAAGCAGCCCTTCCATT-3'，反向为：5'-CCAAATTCTCAGTTGGCACTGG-3'，扩增片段长度322 bp；延伸引物序列为：5'-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCA TCCTGTGACCCCGCCTGT-3'。

1.3.3PCR反应采用20μl扩增反应体系，其中包含1×HotStarTaq缓冲液、3.0 mmol/L镁离子、多重PCR引物、HotStarTaq聚合酶、0.3 mmol/L dNTP、DNA模板。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性15 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min的顺序进行11个循环；然后94℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min的顺序进行24个循环，72℃延伸2 min。PCR产物用虾碱酶和外切酶Ⅰ纯化后进行延伸反应，延伸产物经纯化后再用ABI3130XL测序仪进行测序。测序结果用GeneMapper4.1（Applied biosystems）进行分型分析。

1.4统计学方法

数据结果采用SSPS 13.0软件进行统计分析。组间基因型和等位基因频率分布情况及计数资料比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基因型检测结果

IL-10基因启动子区域rs1800871G/A及rs1800872G/T两位点的SNP分型结果发现，rs1800871G/A位点存在GG、GA及AA 3种基因型，见图1；rs1800872G/T位点存在GG、GT和TT 3种基因型。基因测序也验证了此结果，见图2。

2.2 SNP分型结果

本试验所选研究对象具有群体代表性（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，能代表广西地区人群情况，见表1、2。IL-10基因启动子区域rs1800871G/A和rs1800872G/T两位点基因型及等位基因频率在男性、女性两组间分布差异无统计学意义（P＞0.05），其中，rs1800871G/A位点以GA及AA基因型多见，以A等位基因最为常见；rs1800872G/T以GT和TT基因型多见，以T等位基因最为常见，见表3、4。

2.3不同地区、种族人群间的比较

通过比较广西地区人群与人类基因组计划研究的4个人群（欧洲、中国北京、日本及非洲）以及墨西哥、丹麦及新西兰等人群SNP分型数据，发现IL-10基因启动子区域的rs1800871G/A及rs1800872G/T两位点的基因型及等位基因频率分布与欧洲、非洲、墨西哥[10]及新西兰[11]地区人群比较，差异有统计学意义（P＜0.01），而与日本、中国北京地区人群之间的分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表5、6。

3 讨论

IL-10是一种具有多效应功能、重要的免疫调节细胞因子[1-4]。其主要通过与靶细胞膜上的IL-10受体结合后激活酪氨酸激酶，从而发挥其生物学效应[12]，在机体正常生理条件下，IL-10基因表达受到严格调控，细胞和血浆中IL-10水平很低，在病理条件下，其表达水平增加，来调控机体的抗炎症反应或免疫调节作用。B淋巴细胞合成IL-10可通过调节Th1/Th2细胞之间功能的平衡，抑制对机体伤害性免疫反应，减弱细胞介导的炎症反应，控制机体避免发生瀑布样炎症反应[13]。IL-10的免疫抑制作用，使其对部分抗原有免疫耐受作用，在病原体清除中起到作用，如果IL-10水平过高或者功能紊乱，可导致炎症的形成，如脓毒症[7]、哮喘[8]及强直性脊椎炎[9]等。研究显示IL-10启动子区域基因多态性可能影响基因的转录活性，进而可能影响其血浆表达水平[14-16]。IL-10基因rs1800871G/A和rs1800872G/T两位点单核苷酸多态性可影响IL-10的产量[17]。而IL-10的产量可能与某些疾病起病有关，使不同人群对疾病的易感性及发病率不同。因此，研究IL-10基因SNP在不同地区、种族人群分布特点，可为临床及免疫学研究提供资料。

通过分析广西地区人群中IL-10启动区的rs1800871G/A及rs1800872G/T两位点多态性分布情况，发现在广西地区正常人群中，rs1800871G/A位点以GA基因型（43.4%）、AA基因型（49.0%）多见，以A等位基因（70.7%）最为常见；rs1800872G/T以GT基因型（43.2%）、TT基因型（48.7%）多见，以T等位基因（70.4%）最为常见。分析显示，rs1800871G/A和rs1800872G/T两位点SNP分型在男性、女性之间的分布，其差异无统计学意义。在欧洲、非洲、墨西哥、丹麦及新西兰地区人群中，rs1800871G/A和rs1800872G/T两位点等位基因均以G最为常见，显著高于广西地区人群的分布频率，差异有统计学意义（P＜0.01）。

综上所述，对IL-10基因的rs1800871G/A和rs1800872G/T两位点基因多态性研究，表明其基因型及等位基因在不同地区、种族人群之间存在差异，为了解影响不同地区、不同种族人群对疾病的易感性提供了生物信息学的信息。

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Study on genetic polymorphisms of interleukin 10 gene promoter region*

Hai-yan WANG1,Ye-sheng WEI2,Kong-wen HUANG1,Pin-hu LIAO1,Bin XIOANG3, Jun LI1,Bing HUANG4,Dong-hai HU1,Xiao-wen QIU1
(1.Department of Intensive Care Unit;2.Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities,Baise,Guangxi 533000,P.R.China;3.Department of Intensive Care Unit,the People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning, Guangxi 530021,P.R.China;4.Department of Anesthesiology,the Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning,Guangxi 530021,P.R.China)

【Objective】To investigate the frequency of allele and genotype distribution of single nucleotide polymorphisms(SNPs)in the interleukin 10(IL-10)gene promoter region in the Guangxi population,and to analyze allelic and genotypic diversity of IL-10 gene in different geographical regions and among different races.【Methods】The polymerase chain reaction-single base extension(PCR-SBE)and DNA sequencing techniques were used to analyze the rs1800871G/A and rs1800872G/T polymorphisms at the promoter region of IL-10 in the Guangxi population.The allelic and genotypic diversity of rs1800871G/A and rs1800872G/T were compared with Hapmap-CEU, Hapmap-HCB,Hapmap-JPT and Hapmap-YRI from the Human Genome Project group(Hapmap)data base and with populations in New Zealand,Denmark and Mexico population.【Result】The diversity of rs1800871G/A and rs1800872G/T polymorphisms at the promoter region of IL-10 had no significant difference between female and male group(P＞0.05).Compared with the Hapmap-YRI,and Hapmap-CEU of the Mexicans,Denes,and New Zealan-ders,the diversity of genotypic and allelic of IL-10 were significantly different(P＜0.01).However,compared with Hapmap-JPT and Hapmap-HCB,there were no significant difference(P＞0.05).【Conclusion】The frequencies of polymorphisms distribution of rs1800871G/A and rs1800872G/T at the promoter region of IL-10 were significantly different among the different ethnic groups.

IL-10;polymorphism;genotype

R735.2

A

1005-8982（2015）28-0012-05

2015-05-21

广西自然科学基金重点项目（No：2011GXNSFD018039）；广西科技攻关项目，桂科攻（No：1140003B-93）；广西教育厅科研（No：201012MS176）

廖品琥，E-mail：liaopinhu@163.com，Tel：0776-2848807