骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

骨髓间充质干细胞治疗脑梗死的研究进展

王万松屈新辉1吴晓牧1

(南昌大学医学院,江西南昌330006)

关键词〔〕骨髓间充质干细胞；移植；脑梗死；缺血再灌注

中图分类号〔〕R743.3〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助课题(No.81160148)

通讯作者：屈新辉(1970-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事帕金森病及干细胞的基础和临床研究。

1江西省人民医院神经内科 江西省神经病学研究所

第一作者：王万松(1988-)，男，硕士，主要从事干细胞的基础研究。

脑梗死是常见的脑血管病类型，因脑血管供血障碍而引发缺血性级联反应，造成神经功能缺损。随着人口老龄化，其发病率逐年上升，成为人类死亡和残疾的主要病因之一。目前，针对脑梗死的溶栓治疗因严格的时间窗而限制了获益患者。传统药物治疗虽然使疾病死亡率有所下降，但多数患者仍残存神经功能缺损，严重影响患者生活质量。自干细胞移植理论的兴起，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死的研究中发现移植BMSCs可促进脑梗死后功能改善〔1〕和组织修复〔2〕，并有望成为临床脑梗死治疗的新方法。

1BMSCs的特性

BMSCs是具有自我更新和多向分化能力的中胚层源成体干细胞，最早由Friedenstein等〔3〕从骨髓分离培养，体外形如长梭纺锤状，贴壁集落生长；固定高表达CD90、CD106、CD29等，低表达或不表达CD34、CD45、CD11b等，区别于造血干细胞，被认为是骨髓中的非造血成分，参与造血微环境的构成。一般情况下可分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等中胚层源细胞，而其分化方向和免疫表型受外界微环境因素影响，在诱导因素作用下，可跨胚层分化为神经细胞等〔4〕，并且研究发现脑组织提取液可促进BMSCs分化为神经元和神经胶质细胞〔5〕。

BMSCs具有调节免疫炎症作用，通过影响抗感染和炎症因子的分泌，降低炎症对组织的损伤〔6〕，同时可抑制炎症环境中神经胶质细胞活化〔7〕，具有免疫调节作用。Zimmermann等〔8〕发现BMSCs可通过自身的旁分泌作用调节炎症信号通路，或许BMSCs可通过多重机制调节免疫炎症。另有研究发现BSMCs在缺氧环境中上调缺氧诱导因子(HIF)的表达，并通过加强营养因子和生长因子的分泌起到抗凋亡作用〔9〕。通过免疫炎症的调节及营养和生长因子的分泌，BMSCs具有重塑其所在微环境的功能。BMSCs可自体提供、取材安全、无道德伦理冲突，再者，容易培养、扩增周期短、异体移植未见排异〔10〕，因此，相对其他类型干细胞而言，BMSCs应用更为广泛。

2BMSCs移植治疗脑梗死研究

几乎在所有的动物实验中，移植BMSCs均能有效改善神经功能缺损症状。Suzuki等〔11〕选择脑梗死后6 h移植BMSCs，发现随着梗死体积明显减小，神经功能缺损得到显著改善。而Ding等〔12〕在脑梗死后第5天移植BMSCs，虽然也观察到神经功能缺损症状的好转，但却未发现梗死体积缩小。可见梗死体积并不是功能预后的决定因素，并且能否有效减少梗死体积与移植时间点密切相关。Gutierrez-Fernandez等〔13〕移植BMSCs后虽然也发现梗死体积没有差异，但在改善神经功能缺损的同时，凋亡细胞数目减少，细胞增殖明显，并认为BMSCs可保护脑梗死后受损的细胞免于凋亡，从而修复受损组织，提高神经功能。在关于脑梗死后移植BMSCs减少细胞凋亡的实验中，Deng等〔14〕选择在脑梗死后24 h静脉移植BMSCs，并且在移植后14 d和28 d发现血管内皮生长因子(VEGF)水平的升高和细胞凋亡的减少密切相关，并认为脑梗死缺血半暗带的血液供应对于抗凋亡至关重要。Bao等〔15〕则证实BMSCs通过旁分泌作用，分泌大量脑源性神经营养因子(BDNF)，营养支持受损神经细胞，有效阻止凋亡，并促进神经发生。Li等〔16〕发现移植BMSCs后，脑梗死病灶周围抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)的表达上升，降低炎症对神经细胞的持续损害，减少细胞凋亡，并且室管膜下区细胞增殖明显。如上所述，BMSCs可通过增强血液供应、营养支持和调节炎症起到抗凋亡作用，达到组织修复效果。Zhang等〔17〕证实BMSCs可以激活具有促进细胞增殖功能的sonic hedgehog信号通路，促进脑梗死后少突胶质细胞增殖，修复受损神经轴突。

但是BMSCs对脑梗死的治疗效果仍然受限于BMSCs存活时间短暂的问题。Goldmacher等〔18〕发现移植后脑梗死病灶中的BMSCs在第8天全部消失。为此，为获得更大疗效或发挥BMSCs的治疗潜能，延长干细胞的存活时间成为突破当前瓶颈的新思路。

3BMSCs治疗脑梗死的新策略

3.1缺氧预处理BMSCs脑梗死缺血缺氧导致的炎症反应、氧化应激反应和大量凋亡因子等都不利于移植后BMSCs的存活。但Liu等〔19〕发现BMSCs在含氧量仅为3%的缺氧环境中，激活具有调节细胞增殖、分化和凋亡功能的PI3K/Akt信号通路，上调HIF的表达，提高BMSCs对缺氧环境的耐受，延长BMSCs的存活时间。众多学者重点研究了移植缺氧预处理的BMSCs治疗脑梗死。Wei等〔20〕发现缺氧预处理后的BMSCs归巢明显，可定植于梗死皮层，并且有效减少梗死体积和缺血半暗带处死亡细胞数。另一研究〔21〕发现将缺氧预处理后的BMSCs移植入脑梗死模型中有着强烈的神经发生和血管再生，并认为缺氧预处理能有效提高BMSCs的治疗潜能。

3.2基因修饰BMSCs鉴于BMSCs可旁分泌BDNF、VEGF等蛋白促进脑梗死的修复，利用内源性基因转染BMSCs后移植，则可使相关蛋白基因高表达，将有助于病灶修复。van Velthoven等〔22〕将BDNF基因修饰BMSCs后移植，发现BDNF强烈分泌并有效改善神经功能缺损，但是在移植后第28天与单纯移植BMSCs组神经功能缺损无差异，治疗效果主要受限于基因修饰后BMSCs不能长时间稳定高表达目的蛋白。Liu等〔23〕将一种名为Survivin的抗凋亡基因转染BMSCs后移植，发现在提高BMSCs存活率和延长其存活时间的同时，BMSCs长时间旁分泌VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。Shen等〔24〕将一种名为依达拉奉(MCI-186)的氧自由基清除剂基因转染BMSCs后移植，发现BMSCs存活率的提高使BDNF和VEGF得到高表达。

除了单基因转染，有学者成功将多重基因转染BMSCs，并将其移植治疗脑梗死。Ding等〔12〕将具有促神经发生功能的Noggin基因和神经生长因子(NGF)基因双基因转染BMSCs后移植，两种内源性蛋白协同高表达，较单基因转染移植，BMSCs分化为神经细胞现象更为明显。虽然干细胞结合基因治疗脑梗死更具疗效，但是出于安全性的考虑，其尚未应用于临床。

3.3诱导BMSCs为神经样细胞BMSCs可多向分化，并能分化为神经细胞；但研究发现在脑梗死病灶BMSCs仅少量表达nestin，未能分化为成熟的神经细胞〔25〕。将BMSCs诱导为神经细胞后移植成为一新思路。Heo等〔26〕将BMSCs诱导成为神经元样细胞，移植后抗炎效果加强，但是神经元样细胞在梗死灶边缘并未分化为成熟的神经细胞。显然诱导BMSCs为神经细胞后移植仍不成熟。首先，对于诱导BMSCs为神经细胞的有效性存在争议，Thomas等〔27〕发现诱导的BMSCs仅具有神经细胞形态而不具备相应功能。其次应考虑诱导剂的毒副作用，尤其是化学诱导剂具有的细胞毒性作用，将会影响细胞骨架的稳定和变形能力。

4移植BMSCs的途径和数量

目前关于BMSCs的移植途径主要为静脉途径、颈动脉途径和立体定向途径。(1)静脉途径：其最大优点在于创伤微小，风险较低，可操作性强。缺点在于BMSCs归巢量微少，大部分细胞都滞留于肺脾等外周器官〔28〕，而且细胞容易相互凝集形成细胞栓子，造成外周器官栓塞，尤其以肺栓塞多见。(2)颈动脉途径：优点在于可以避免外周器官阻滞BMSCs，同时可以最小创伤向病灶移植大量BMSCs。缺点在于容易造成脑动脉栓塞形成，引发脑梗死。(3)立体定向途径：其优点在于直接向病灶移植BMSCs，提高细胞利用率，增强疗效。Kawabori等〔29〕证实立体定向途径移植1 106的细胞量，其疗效优于静脉途径移植3 106的细胞量。其缺点在于损害脑组织、创伤较大，引发颅内高压，操作难度大。

关于移植细胞数量，目前主要集中在1×104～107等范围〔13，30〕，Wang等〔30〕证实移植1×106～107的细胞量疗效优于1×104～105的细胞量。但是这并不意味移植的细胞数量越多，疗效越好。首先，血液途径移植，细胞浓度越高越容易形成细胞栓塞。其次，梗死灶贫瘠的微环境不足以营养支持大量的干细胞，造成干细胞的存活率降低，结果可能适得其反。

5BMSCs治疗脑梗死的具体机制

BMSCs治疗脑梗死有其独特的优点：(1)都能有效改善神经功能缺损症状。(2)相对其他治疗措施，极大延长了治疗时间窗〔31〕。(3)是基因工程治疗的良好载体。(4)未见肿瘤等不良事件发生。

但是目前对于BMSCs治疗脑梗死的具体机制不明，可能与以下几个方面有关。(1)细胞替代：BMSCs移植治疗脑梗死最初目的在于替代坏死细胞以恢复受损结构。然而其有效性饱受争议。首先，血管途径移植BMSCs的归巢量微少〔28〕及在脑梗死慢性期胶质瘢痕的限制阻碍，能有效定植坏死部位的干细胞数量微少。再者，移植后虽然有小部分BMSCs表达神经元和胶质细胞表面标志物，但是其是否具有相应功能有待进一步确定。(2)营养支持：研究表明移植BMSCs后凋亡的细胞数显著减少并改善神经缺损，这可能与BMSCs的营养支持相关。研究表明移植后BMSCs可分泌BDNF、GDNF、bFGF等多种营养因子〔15，23〕，对受损的神经细胞提供营养支持。(3)免疫炎症调节：BMSCs能旁分泌TGF-β(转化生长因子)抑制免疫细胞的播散，有效减少炎症细胞的浸润〔32〕，可调节外周血中的调节性T细胞活性，减少炎症细胞对梗死灶损害〔30〕。(4)血管再生：BMSCs可分泌VEGF支持血管再生，并且研究表明移植BMSCs后缺血半暗带血管发生明显〔14〕。(5)促进内源性修复：Li等〔33〕研究证实脑梗死后大脑自身启动自我修复，包括祖细胞的生成、神经发生和血管新生。而BMSCs可支持祖细胞的生成、促进神经发生和加强血管新生以促进修复。

在脑梗死后不同时期移植BMSCs，其具体治疗机制可能有所偏重。研究证实脑梗死早期移植BMSCs主要通过炎症抑制和营养支持发挥疗效〔34〕，而恢复期移植BMSCs则偏重于血管再生〔31〕和抑制胶质瘢痕形成以恢复功能。

6展望

目前已从多角度多方向研究利用BMSCs移植治疗脑梗死，并且临床试验业已开展，但是仍然有着许多问题亟需解决和值得深入研究。这包括预处理干细胞的最佳方式、影响干细胞存活的决定因素、移植模式以及干细胞在体内的踪迹和最终结局，这些问题的尽早解决关系到治疗效果的稳定性和安全性，有利于进一步开展临床试验。

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〔2014-11-22修回〕

(编辑袁左鸣)