DNA甲基化标记及其在猪生产上的研究进展

蒋 明，陈 斌，李 智，董莲花

(湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128)

DNA甲基化标记及其在猪生产上的研究进展

蒋 明，陈 斌*，李 智，董莲花

(湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128)

表观遗传学是在不影响DNA序列变化的前提下，而发生的可遗传基因表达的变化[1]。DNA甲基化是重要的表观遗传学现象之一，它的主要作用是通过与转录因子相互作用或者改变染色质的结构来抑制基因的表达[2]，启动子区和转录起始位点的DNA的甲基化作用尤其突出，DNA甲基化参与生命体活动的很多过程，目前检测DNA甲基化的方法有亚硫酸氢钠处理为基础的PCR方法、酶切处理为基础的Southern杂交和免疫沉淀法，这些方法总的来说就是整体水平上的基因组甲基化检测、特异性位点的检测以及甲基化新位点的寻找。供查询甲基化位点以及相关研究的数据库有MethDB、MethCancerDB、MethyCancer和Pubmeth[3]。近年来，由于DNA甲基化的高通量检测技术的出现，DNA甲基化在生物信息方面的研究得到了很大的发展。

1  DNA甲基化标记

DNA甲基化是在甲基化转移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤（A）或者胞嘧啶（C）与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基共价结合[4]，存在N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和7-甲基鸟嘌呤3种形式，主要以5-甲基胞嘧啶形式存在。哺乳动物的细胞内存在3种DNMT，分别为DNMT1、DNMT2和DNMT3[5-7]。它们在DNA甲基化的建立、维持和去甲基化过程中起着非常重要的作用，DNMT1是最早被发现的DNA甲基化转移酶，与细胞内定位和催化机能有关联，主要功能是维持细胞分裂过程中新生链的DNA甲基化状态、形式和甲基化转移酶活性。它的过量表达可能导致癌症[8]。DNMT3中又包含DNMT3a、DNMT3b与DNMT3L， 是机体在早期发育阶段时DNA甲基化过程所不可缺少的一部分，参与DNA的重新甲基化过程。对于DNMT2的研究，相对的比较少，而且目前对其功能的认识还存在争议，因为它的甲基化酶活性非常的弱。

甲基化主要是在CpG二核苷酸位点，在DNA序列中的某些区域，CpG序列密集，达到均值5倍以上的密度，鸟嘌呤和胞嘧啶在这些区域富集，我们称之为CpG岛（CpG island），CpG岛的维持是靠生命体进化来完成的。由于5-甲基胞嘧啶可以与胸腺嘧啶相互转化，导致CpG在哺乳动物基因组中的分布是不均匀的，研究表明，基因启动子和第一外显子处没有甲基化的CpG占其CpG总量的50%以上[9]，但是对于整个生命体来说，将近80%的CpG均发生甲基化，而且通常位于组织特异基因的启动子和调节区的转座元件，这些地方往往是染色体着丝粒的重复区域和重复序列所在处[10]。启动子区CpG甲基化的异常会抑制转录的过程，有研究显示，CpG的甲基化与基因的转录活性呈负相关，如果CpG高密度的甲基化将会彻底的抑制启动子的转录过程。

2  甲基化与基因组印记

哺乳动物的绝大多数基因进行父母双方的等位基因表达，等位基因表观遗传的不对称修饰将会导致基因组印记，这样的等位基因归类为“印记基因”，呈现出差异性表达，使得后代在转录表达的时候只继承亲本一方的遗传信息，而亲本的另一方处于沉默状态，其中父本等位基因处于沉默状态的称之为父系印记，反之亦然。DNA甲基化是调控印记的重要方式之一，在印记的维持中起着举足轻重的作用，是印记所必须的。印记基因常常伴随着差异甲基化区（differentially methylated regions，DMRs），DNA通过甲基化修饰抑制顺式作用元件和反式作用因子的结合，使得基因的表达量或者是其表达的状态从本质上改变，继而导致基因的表达成为了单等位，即基因印记。哺乳动物体内印记基因的甲基化的建立是在两个不同的发育阶段[11]，第1阶段为合子阶段，生殖细胞发育的时候，印记是消失的，这个阶段DNA甲基化水平得到了大幅度的上升，等到精子和卵细胞结合成合子后，基因组印记开始建立并维持甲基化；第2阶段为合子植入后期，处于该阶段的基因进行二次甲基化，同时引起次级印记的建立，这次印记的建立是可以遗传的，并存在于整个生命过程中。

3  甲基化与X染色体失活

雌性动物体内含有2条X染色体，雄性动物体内含有1条X染色体，1条Y染色体，胚胎发育的早期阶段，为了使雌性与雄性性染色体在表达上的剂量平衡，雌性动物体内会随机失活一条X染色体来满足早期胚胎的生长发育，X染色体失活（X-chromosome inactivation，XCI）是表观遗传修饰的重要组成部分，是一个非常系统化的过程。X失活中心(X-inactivationcenter，XIC)是X染色体失活的核心，由不编码蛋白质的RNA（noncoding RNA）对其核心进行调节和 修 饰， 其 中RNA Xist(Inactive X-specifictranscript)最为重要，这段RNA的长度为17 kb，它的主要职能是招募Polycomb蛋白质(复合物蛋白)，这种蛋白质可以包裹X染色体，从而使得X染色体沉默[12]。曹更生等[13]研究表明克隆Holstein奶牛囊胚Xist基因的DNA甲基化程度是处于较低水平，其中来源胎儿成纤维细胞（FFB）的Xist基因甲基化程度为43%，输卵管上皮细胞处的比较少，仅仅只有17%，与体细胞相比，Xist基因比胚胎时期高，尤其是输卵管处的甲基化，比前者足足高了46%，即Xist基因的甲基化不是一成不变的，而是可以被重新编码。陈洁等[14]为了研究DNA甲基化在核移植过程中是否也是充分表观重编码，通过亚硫酸氢盐测序法，对比分析H19与Xist基因在核移植牛与正常牛肺脏的DNA甲基化程度，结果显示核移植牛的Xist甲基化程度比正常的高，但是他们二者之间的差异不显著，即核移植过程中DNA甲基化可能出现不完全重编码，而其他动物之间是否也会出现以上的现象，还有待科研者做进一步的研究。

4  甲基化与核小体定位

核小体是染色质的基本构成单位，核小体与核小体之间以Linker DNA连接，并形成念珠状结构。在真核生物的细胞中， H4、H3、H2B和H2A这4种组蛋白各2组拷贝被DNA分子盘绕形成组蛋白八聚体。组蛋白八聚体在DNA双螺旋上的具体位置称之为核小体定位。细分可将核小体定位两类[15]：1)染色体座位相对于DNA中心点的平移定位；2)组蛋白结合表面与DNA双螺旋的旋转定位。目前研究表明，核小体定位与调控进化、DNA复制、DNA修复以及基因转录调控等过程中有着十分重要的作用。组蛋白本身具有静电位阻的作用，这个功能可以阻止其他蛋白质与核小体DNA结合的机会，这些蛋白质包括RNA聚合酶、DNA聚合酶以及其他类负责生命过程的酶类，只有缺乏核小体的区域，基因转录才可以被启动，遗传信息才能得以表达[16]。当启动子区域内定位有核小体，而且核小体占据转录因子结合位点（TFBS）时，转录因子将不能与TFBS相结合，基因的转录过程被抑制。刘宏德等[17]通过研究和分析TFBS和转录起始位点（TSS）周围核小体定位情况和DNA甲基化与核小体定位之间的联系，实验结果表明TSS与TFBS周围核小体的变化是一个动态过程，处于定位和缺失的一个循环状态，DNA甲基化与核小体定位在TFBS之间是一种互补状态，核小体定位和DNA低甲基化之间有关联，在TSS周围，却是以同步模式存在，即DNA高甲基化的同时也会提高核小体水平。Chodavarapu等[18]通过对拟南芥的大量单核小体进行全基因组核小体定位分析，表明核小体DNA处的甲基化程度高于侧翼部位的DNA，核小体的定位影响整个基因组中DNA的甲基化模式，DNMT偏向于以核小体DNA为靶体，这个现象同样在人类基因组中出现，即核小体与DNA甲基化之间的联系是保守的，在这个实验中，同时还发现核小体在外显子处富集，尤其偏向定位于外显子和内含子的边界。

5  甲基化相关的miRNAs

microRNA(miRNAs)是 一 类 内源性的非编码RNA分子，长度大约为22～24个核苷酸[19]，大部分的miRNAs在那些容易发生结构变化的染色体区域定位，而且小RNA在进化过程中的保守性非常的高，靶mRNA能够特异性地与miRNA碱基互补配对，降解mRNA或抑制mRNA的翻译过程，从而对基因的转录后水平进行表达调控[20]。miRNA的产生和作用过程需要2个关键酶：DCL1和AGO1。它们是miRNA能够稳定维持的重要酶类，目前研究发现，miRNA168与miRNA162在AGO1和DCL1的作用下合成，这两个miRNA的存在使得miRNA的产生和作用机制处于一个反馈调控的系统之中[21]。miRNA编码的基因启动子序列的CpG岛可以发生DNA的甲基化，DNA甲基化引起的表达沉默能够对miRNA在转录水平上进行调节，同时，miRNA也可以对表观遗传进行调控，前面介绍过DNA甲基化是在甲基化转移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤（A）或者胞嘧啶（C）与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基共价结合的过程，miRNA可以影响DNMT的表达从而调节DNA的甲基化[22]，Han等[23]在研究结肠癌细胞系HCT116时发现，DNA的甲基化能够调控约为10%左右的miRNA，原因在于CpG岛高水平的去甲基化能够引起这些基因的重新表达。Zhou X等[24]还发现人类被miRNA编码的基因的上流区域中有三分之一内含有CpG岛，而且许多miRNAs（如：miR-124a、miR-137、miR-25等 ）的异常甲基化将会导致基因的表达沉默，继而导致肿瘤的形成，因此加强对DNA甲基化与miRNA的研究意义重大。

6  DNA甲基化与猪的胴体性状、生长性状的关联

在猪的实践育种工作中，常常采用选种选配的手段对种公畜和母畜进行合理的搭配，利用杂种优势来提高胴体重、瘦肉率、屠宰率以及眼肌面积等胴体性状，杂种优势的机制是基因的加性效应以及非加性效应的互补，这些机制在实际操作过程中存在一些不足，给杂种优势的预测带来一定的困难，近年来，科研者开始将目光转向分子水平。随着甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术的成熟，人们开始探讨猪的基因组中CpG岛上个体DNA基因甲基化差异对胴体性状、生长性状的影响。蒋曹德等[25]从3个层次（个体特殊甲基化百分差异、个体中性甲基化百分差异和个体全部甲基化百分差异）对大白和梅山猪二元杂的胴体性状进行分析，结果显示各性状值是随着个体特殊甲基化百分差异的变化而变化的，同时经过回归分析得出平均背膘厚、平均臀部背膘厚等性状与特殊甲基化百分差异显著，DNA甲基化标记是可以在分子标记中作为理论根据的。杨春[26]对莱芜猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉和胃7个组织用荧光定量化敏感扩增片段多态性方法（fluorescent labeled methylation sensitive amplified polymorphism，FMSAP）进行全基因组DNA甲基化研究。结果显示，不同组织之间的甲基化程度都不显著，但肌肉组织总的DNA甲基化程度在所有组织中是最高的，肝脏的最低，杨思强[27]还发现DNA的甲基化与猪的睾丸生成过程也有一定的联系，4～30日龄时，睾丸中的甲基化主要集中在间质区域，这时睾丸也是以间质细胞发育为主，表明睾丸基因的甲基化与其发育程度同步。

7  小结

DNA甲基化在真核生物中是一种非常重要的表观遗传学标记，能够在不影响DNA序列变化的前提下，而引起可遗传基因表达的变化，甲基化主要发生在CpG二核苷酸位点，是在甲基化转移酶的催化作用下使得DNA序列中腺嘌呤或者胞嘧啶与S-腺苷甲硫氨酸上的甲基共价结合的产物，在哺乳动物的细胞内存在DNMT1、DNMT2和DNMT3这3种甲基化转移酶，它们在DNA甲基化的建立、维持和去甲基化过程中起着非常重要的作用。DNA甲基化与基因组印记、X染色体失活和核小体定位之间有着密切关系，而且还影响着动物的胴体品质、生长性状和疾病生成的机制，有着非常重要的研究意义。

[1] Madrigano J， Baccarelli A，Mittleman M A， et al. Aging and epigenetics[J].Epigenetics， 2012， 7(1)：63-70.

[2] 赵云雷，叶武威，王俊娟，等.DNA 甲基化与植物抗逆性研究进展[J].西北植物学报，2009，29 (7)： 1479-1489.

[3] 凡时财，张学工.DNA甲基化的生物信息学研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2009， 36(2)： 143-150.

[4] 赵敬贤，张路培，高会江，等.全基因组DNA甲基化图谱及其在动物遗传育种中的研究进展[J].生物技术通报，2013， (9)： 47-53

[5] Song J， Rechkoblit O， Bestor T H， et al. Structure of DNMT1-DNA complex reveals a role for autoinhibition in maintenance DNA methylation[J]. Science，2011，331(6020)： 1036-1040.

[6] Raddatz G， Guzzardo P M， Olova N，et al. Dnmt2-dependent methylomes lack defined DNA methylation patterns[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(21)： 8627-8631.

[7] O'Doherty A M， O'Shea L C，Fair T. Bovine DNA methylation imprints are established in an oocyte size-specific manner，which are coordinated with the expression of the DNMT3 family proteins[J]. Biology of reproduction，2012，86(3)： 67.

[8] 吴琼， 邵国， 张培礼. DNA 甲基化转移酶与乳腺癌相关性的研究进展[J]. 包头医学院学报， 2013， 29(6)： 134-136.

[9] Deaton A M， Bird A. CpG islands and the regulation of transcription[J]. Genes & development， 2011， 25(10)：1010-1022.

[10] Sandoval J， Heyn H， Moran S， et al. Validation of a DNA methylation microarray for 450，000 CpG sites in the human genome[J]. Epigenetics，2011， 6(6)： 692-702.

[11] 胡嘉祺. Dlk1-Dio3 印记区域 Meg8基因及 IG-DMR 在体细胞核移植牛中DNA 甲基化状态分析[D].保定： 河北农业大学， 2012.

[12] Wutz A. Gene silencing in X-chromosome inactivation：advances in understanding facultative heterochromatin formation[J]. Nature Reviews Genetics，2011，12(8)：542-553.

[13] 曹更生，高宇，戴蕴平，等.牛不同供体核克隆囊胚 Xist 基因 DNA 甲基化程度的比较研究[J]. 生物化学与生物物理进展，2006，33(10)：994-999.

[14] 陈洁，李冬杰，刘艳琴，等.体细胞核移植牛肺脏中 H19 和 Xist 基因的 DNA 甲基化状态[J]. 科学通报，2008，53(11)： 1305-1310.

[15] Albert I， Mavrich T N， Tomsho L P， et al. Translational and rotational settings of H2A. Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiaegenome[J]. Nature，2007，446(7135)： 572-576.

[16] Brogaard K， Xi L， Wang J P， et al. A base pair resolution map of nucleosome positions in yeast[J]. Nature， 2012， 486(7404)： 496.

[17] 刘宏德， 孙啸. 核小体定位模式及其与 DNA 甲基化位点分布的关系[J].中国生物化学与分子生物学报， 2011，27(3)： 248-253.

[18] Chodavarapu R K， Feng S，Bernatavichute Y V， et al. Relationship between nucleosome positioning and DNA methylation[J]. Nature， 2010， 466(7304)：388-392.

[19] 蒋明，冉茂良，陈斌，等.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通道与自噬的相关研究[J].动物营养学报，2014，26（7）：1738-1745

[20] O'Donnell K A， Wentzel E A， Zeller K I， et al. c-Mycregulated microRNAs modulate E2F1 expression[J]. nature， 2005，435(7043)： 839-843.

[21] Balmer D， Mauch-Mani B. Small Yet Mighty MicroRNAs in Plant-Microbe Interactions[J]. MicroRNA，2013， 2(1)： 73-80.

[22] 王峰， 秦环龙.大肠癌 microRNA 与DNA甲基化修饰相互调控的研究进展[J].世界华人消化杂志，2010，18(8)： 808.

[23] Han L，Witmer P D W，Casey E，et al.DNA methylation regulates MicroRNA expression[J]. Cancer Biology and Therapy，2007，6(8)： 1284.

[24] Zhou X， Ruan J， Wang G， et al. Characterization and identification of microRNA core promoters in four model species[J]. PLoS computational biology， 2007，3(3)：412-423.

[25] 蒋曹德，邓昌彦，熊远著.猪个体 DNA甲基化百分差异与胴体性状的关系[J].农业生物技术学报，2005，13(2)： 179-185.

[26] 杨春.猪不同组织和不同品种肌肉组织基因组 DNA 甲基化分析 [D].长春：吉林大学，2011.

[27] 杨思强.仔猪睾丸组织 DNA 甲基化及印记基因表达的研究[D]. 雅安：四川农业大学， 2013.

2014-09-01）

国家现代农业产业技术体系建设专项资金赞助（CARS-36）

*通讯作者：陈斌，chenbin7586@126.com