孢子丝菌病及影响申克孢子丝菌毒力因素的研究进展

孢子丝菌病及影响申克孢子丝菌毒力因素的研究进展

毕云斐齐琳李福秋王舒

(吉林大学第二医院皮肤科,吉林长春130041)

关键词〔〕孢子丝菌病；申克孢子丝菌；毒力；黑素

中图分类号〔〕R756〔文献标识码〕A〔

第一作者：毕云斐(1989-)，女，硕士，主要从事皮肤病与性病学研究。

孢子丝菌病是一种由双相病原真菌申克孢子丝菌感染引起的亚急性或慢性深部真菌病。其不同临床表现取决于申克孢子丝菌菌株的不同毒力因素以及宿主的不同免疫状态。黑色素在真菌致病过程中起着重要的作用，研究黑色素与真菌致病毒力之间的关系，是研究真菌发病机制和真菌耐药性等的重要工具。

1孢子丝菌病

孢子丝菌病广泛分布于世界各地，尤其是热带及亚热带地区，为全球播散性人、畜共患疾病，人群普遍易感，一般呈散发趋势，但也曾有大规模暴发的报道〔1〕。其病原体主要通过破损的皮肤黏膜进入，引起皮肤黏膜、皮下组织及局部淋巴组织的化脓破溃及皮下结节；吸入分生孢子可导致肺部感染；偶可经血行播散至骨骼、眼、中枢神经系统和内脏引起多系统损害，但较少见，偶见于酗酒、人免疫缺陷病毒(HIV)感染等免疫低下患者〔2〕。

孢子丝菌是一种自然界普遍存在的腐生菌，在土壤、木材、植物、海洋生物、昆虫等均可分离出〔3〕。其为双相型真菌，在25℃~27℃表现为菌丝相，而在35℃~37℃宿主中表现为酵母相。不同临床型别的申克孢子丝菌分离株生长温度略有不同，临床表现为皮肤固定型的菌株在35℃生长良好，但在37℃生长则受抑制，而临床表现为淋巴管型和播散型的分离株在37℃可生长良好〔4〕。同时，根据致病菌株间的表型及基因型存在差别，以及相同临床表现的患者对相同治疗方法的反应不同，在不同菌种之间对抗真菌药物的敏感性存在较大差异，推测申克孢子丝菌可能是一种同型种复合体，已有研究者将孢子丝菌进一步分为申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌、白孢子丝菌及申克孢子丝菌卢艾里变种6个种或变种〔5〕，其中，申克孢子丝菌和球孢子丝菌在世界范围广泛分布〔6〕。目前研究认为在我国病原菌主要由申克孢子丝菌和球孢子丝菌构成，Marimon〔7~9〕等均认为我国菌种分布可能以球形孢子丝菌为主。同时不同菌种之间的致病力以及对抗真菌药物的敏感性等也存在差异〔10〕。

临床上将本病分为皮肤型和皮肤外型。其中皮肤型孢子丝菌病又分为固定型、淋巴管型和播散型；而皮肤外孢子丝菌病又称内脏型或系统性孢子丝菌病，多累及糖尿病、酗酒、应用免疫抑制剂、HIV感染等免疫力低下者，多由血行播散引起，可侵犯骨骼、眼、中枢神经系统、心、肝、脾、胰、肾、睾丸及甲状腺等器官，吸入孢子可发生肺孢子丝菌病。

孢子丝菌病的传统检查方法主要为真菌培养和组织病理学检查，近年来分子生物学领域的检查手段，包括免疫荧光抗体检查、孢子丝菌素皮肤试验、聚合酶链反应技术(PCR)、特异性探针杂交、限制性片段长度多态性分析等，在孢子丝菌病的诊断中发挥越来越重要的作用〔11〕。病理检查早期损害一般较轻微，表现中性粒细胞、组织细胞、浆细胞及淋巴细胞等形成的非特异性炎症浸润，主要表现为真皮非特异性炎性肉芽肿。典型的特征性改变为“三区结构”的形成，中央：为由中性粒细胞构成、偶有少数嗜酸性粒细胞的化脓区；外绕：以由组织细胞、上皮样细胞构成、偶有多核巨细胞的结核样区；最外：由淋巴细胞、浆细胞构成的梅毒样区。过碘酸雪夫(PAS)染色较易发现以酵母型存在的病原菌、星状体、雪茄样小体，偶见菌丝。实验室检查病灶组织液、脓液或坏死组织涂片，革兰染色或PAS染色，高倍镜下可见G+或PAS阳性的卵圆形或梭形小体；真菌培养可见初为乳白色酵母样菌落，以后成为咖啡色丝状菌落。

孢子丝菌病的治疗主要是口服药物治疗，包括饱和碘化钾溶液(SSKI)、伊曲康唑(ITR)、特比萘芬(TBF)、氟康唑(FLU)、两性霉素B(AmB)等，SSKI曾为治疗皮肤型孢子丝菌病的首选药物。目前孢子丝菌病治疗指南〔12〕推荐ITR为治疗皮肤型孢子丝菌病及骨关节病型的首选药物，当患者因禁忌证、药物相互作用、副作用等而不能应用ITR治疗时，可选择TBF进行治疗，当固定型及淋巴管型孢子丝菌病患者不能耐受ITR及TBF时，可用FLU治疗，而对于播散型孢子丝菌病、肺孢子丝菌病、脑膜孢子丝菌病指南推荐首选AmB治疗。温热治疗对于局部固定型效果较好，可与口服药物治疗联合应用，也可用于合并妊娠、活动性肺结核、碘过敏等的患者〔13〕。手术治疗一般用于纤维包裹明显的皮肤固定型及肺孢子丝菌病的慢性空洞型纤维结节，但均需配合以药物治疗。近年来，研究发现孢子丝菌黑色素在其致病机制中发挥重要作用〔14〕，随着病原真菌对抗真菌药物耐药现象的增多，未来研发抑制其黑色素生物合成的新型抗真菌药物可能成为研究的新靶点。

2影响孢子丝菌毒力的因素

研究认为，孢子丝菌病的不同临床表现形式主要取决于宿主的免疫状态以及孢子丝菌的毒力因素〔15〕。目前关于影响申克孢子丝菌毒力的热点因素的研究包括如下方面。

2.1黑色素黑色素是一类广泛存在于动植物和微生物中的深褐色至黑色的复合物，是一种带负电荷的疏水性多聚芳香族化合物。黑色素已在真菌致病力研究中占有越来越重要的位置〔16〕。真菌黑色素两种最重要的合成途径分别是1，8-二羟基萘(DHN)途径和二羟苯基丙氨酸(DOPA)途径，不同种真菌合成黑色素的途径不同〔17〕，DHN-黑色素主要见于子囊菌真菌，DOPA-黑色素则常见于新生隐球菌、组织胞浆菌等〔17〕。Romero-Martinez等〔14〕研究发现申克孢子丝菌黑色素可通过DHN途径合成，但最新研究〔18〕表明申克孢子丝菌黑色素合成过程也可以利用酚类化合物，提示其黑色素合成途径或许也包括DOPA途径。黑色素可以保护真菌细胞，具有抗氧化，抗恶劣环境如紫外线和极端温度，清除自由基，抗离子辐射，增强真菌细胞表面的黏附性，抗宿主细胞吞噬作用，降低抗真菌药的抗真菌作用。Morris-Jones等〔19〕提示黑色素保护申克孢子丝菌免受某些氧化抗菌化合物和巨噬细胞的攻击。目前关于真菌黑色素与致病力关系的研究认为，黑色素并不是真菌生长所必需，但却是某些致病真菌的重要致病因子〔20〕。

2.2黏附力因素黏附是致病菌在宿主中传播的先决条件，一些病原真菌，如白色念珠菌、烟曲霉等与宿主组织黏附性已被广泛研究。

在申克孢子丝菌的粘附性实验中，Lima等〔21〕通过ELISA法证明其分生孢子与酵母细胞可在体外与宿主的细胞外基质(ECM)如Ⅱ型胶原蛋白、纤维蛋白原以及层粘连蛋白等结合,推测这可能与孢子丝菌在宿主内的播散有关。但分生孢子与酵母细胞对ECM的黏附力略有不同，其中分生孢子对纤维蛋白原或凝血酶敏感素无显著黏附，但酵母细胞显示对纤维蛋白原黏附。其中纤维结合蛋白是一种大(420kDa)的二聚体糖蛋白，是一种多功能的ECM蛋白，在细胞黏附和播散中起核心作用〔22〕。Iima等〔23〕通过间接免疫荧光法和流式细胞术证明申克孢子丝菌酵母细胞和分生孢子都具有与层粘连蛋白和纤维结合素黏附的能力，且酵母细胞具有较分生孢子的黏附能力更为显著,对纤维结合素和层粘连蛋白的结合也具有剂量依赖性和特异性。此外，对孢子丝菌细胞壁糖成分的研究发现,细胞壁组成成分的不同被认为与申克孢子丝菌的致病力相关〔24〕，同时细胞壁肽聚糖也参与了黏附过程〔25,26〕，如Ruiz-Baca等〔25〕从申克孢子丝菌酵母细胞细胞壁分离出一种70 kDa的糖蛋白被认为参与黏附细胞外基质蛋白的过程。

此外，申克孢子丝菌酵母细胞可与宿主内皮细胞黏附，Sandoval-Bernal等〔26〕通过生物素标记配体分析，发现其酵母细胞细胞壁蛋白电泳分析中的5种蛋白在与内皮细胞的黏附过程中密切相关，同时发现细胞壁表面甘露糖也参与了与内皮细胞的黏附过程。

3病原真菌黑色素

虽然黑色素不是真菌的生长所必需，但在真菌侵袭宿主和抵御外界恶劣环境方面起重要作用〔27〕，某些植物真菌的黑色素可以增加其对宿主的侵袭能力，如瓜类炭疽病菌、稻瘟病病菌的黑色素能沉积在附着细胞壁内层，防止形成膨胀压的溶质外渗，产生较大的机械压力，有利于真菌侵入宿主〔28〕。病原真菌黑色素与真菌毒力的研究。更多集中于黑色素在环境及感染过程中保护菌体存活及免受各种因素破坏的机制，如抗氧化、抗辐射、耐受抗真菌药物及抗宿主防御机制等〔29〕。

3.1黑色素理化性质及分类黑色素广泛分布于自然界，根据其颜色、化学组成和形成途径的不同而分为真黑色素、棕黑色素、异黑色素。根据合成途径不同，将黑色素分为DHN-黑色素和DOPA-黑色素两种。但是不论黑色素的来源和组成结构有何不同，所有黑色素的理化性质都相同，(1)溶解性：天然黑色素不溶于酸性溶液与常见有机溶剂(如乙醇、氯仿、苯、丙酮、乙醚等)，微溶于水，但可溶于碱性溶液。(2)光吸收性：黑色素对紫外线和可见光具有广阔的吸收带(150~800 nm)，且在紫外波长下吸收值最大，且能吸收一些低能量的辐射。(3)氧化还原性：黑色素含有多种功能团，能产生半醌自由基，既可作为电子供体也可作为电子受体〔30〕，其本身具有独特的自由基特性，同时可作为自由基消除剂，具有很强的氧化还原的能力。(4)金属亲和性：研究发现，黑色素存在对苯二酚和苯醌两种基团，这两种基团在其螯合金属离子的过程中起主要作用，同时由于一些金属离子可介导脂质过氧化，间接起到抗氧化作用。

3.2致病真菌黑色素的作用机制研究发现，很多真菌的黑色素都分布在菌体的最外层，Gómez等〔31〕从巴西副球孢子菌以及Morris-Jones等〔19〕从培养的申克孢子丝菌获得分生孢子及酵母细胞，用蛋白水解酶、变性剂、热盐酸处理后，得到与原始孢子及酵母细胞形状大小相似的黑色颗粒层，扫描电镜等证实该颗粒层是黑色素。故认为黑色素是在菌体与周围不利的环境间形成的一道屏障，使得菌体能够抵抗周围环境的理化因素，防御紫外线破坏以及抗宿主细胞吞噬等，同时黑色素上述理化性质决定其具有强大的生物功能。黑色素分布的位置及其特有的理化性质使病原菌在环境中更易存活，在感染中保护菌体免受各种环境因素的破坏。侯幼红等〔32〕总结致病真菌黑色素的作用机制有抗电离辐射、抗极端pH和温度的环境、增强真菌细胞表面的黏附性、抵抗宿主细胞吞噬作用、抗氧化还原、降低抗真菌药物的抗真菌作用等方面。黑色素对真菌往往提供一种保护机制，使其免受恶劣环境的损伤。黑色素的金属亲和性使其可以结合自然界中具有潜在伤害可能的重金属元素，保护真菌免受伤害。黑色素因其具有氧化还原性故能有效地清除自由基，此外van Duin等〔33〕研究发现，新生隐球菌及荚膜组织胞质菌黑色素具有抗两性霉素B及卡泊芬净的作用。对黑色素的抗宿主免疫反应研究显示，在新生隐球菌、着色芽生菌、申克孢子丝菌等的实验研究中，黑色素具有在体内外抗宿主吞噬细胞吞噬的作用〔34，35〕。同时黑色素具有抗原性与抗炎特性，可在小鼠体内诱导较强的T细胞依赖性抗体应答反应，新型隐球菌产生的黑色素可激活补体反应〔36,37〕。

综上所述，黑色素在真菌致病过程中发挥复杂的作用，其作为申克孢子丝菌的一种重要毒力因子，参与其致病过程。可以通过测量真菌黑色素含量的不同，进一步验证其与真菌毒力的关系，有助于对真菌发病机制的研究。

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〔2014-03-16修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)