多重PCR和间隔区寡核苷酸分型技术应用于不同流行地区的牛结核病研究

张喜悦，范承祥，杜鹏飞，曹 瑞，呼西旦，王淑娟，范伟兴

多重PCR和间隔区寡核苷酸分型技术应用于不同流行地区的牛结核病研究

张喜悦1，范承祥2，杜鹏飞1，曹 瑞1，呼西旦3，王淑娟1，范伟兴1

目的 在牛结核病监测中联合应用菌株的多重PCR鉴定和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)，快速鉴定分离菌株并分析不同地区流行菌株的特点。方法 分别在牛结核病清净地区和流行地区进行牛型PPD变态反应试验，扑杀阳性牛后进行病理检查，并采集病料分离细菌。获取分离菌株，进行多重PCR鉴定和spoligotyping分型，分析不同地区的菌株特征。结果 结核病清净地区监测到16头牛型PPD阳性牛，扑杀后未见有病变，采集病料分离到4株分枝杆菌，经多重PCR鉴定均为非典型分枝杆菌。流行地区监测牛型PPD阳性23头，扑杀后发现14头有病变，采集病料后共有11头分离到疑似菌，经多重PCR鉴定均为牛型分枝杆菌。用spoligotyping分析共分为4个型，其中2个为未见报道的新型，报英国AHVLA牛结核spoligotyping数据库后获取通用编号SB1903和SB1904。结论 分离菌株中的优势菌株为首次报道的SB1903，但也检出有国际流行菌株SB0140，证实该地区牛结核病的流行是以“独特菌型地域内相互传播为主、输入性感染为辅”为特征。本次监测发现国内有SB0140菌株分布，提示应调查该型菌是否已经传染至我国人间。

牛结核；多重PCR；间隔区寡核苷酸分型

Supported by the National Basic Research Program of China (No. 2012FY111000) and the China Agriculture (Dairy) Research System (No. CARS37) Corresponding author: Fan Wei-xing, Email: fwxsjl@126.com

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种人兽共患病。确诊牛结核病的关键是能够分离到并准确鉴定病原。传统的牛结核分枝杆菌鉴定方法主要包括细菌形态、染色特性和生化鉴定等，这些鉴定方法操作复杂且需时较长。根据比较基因组学的原理，Wilton等[1]建立了可以鉴定多种分枝杆菌的分枝杆菌多重PCR并在世界范围内得到了广泛的应用。近年来也出现了一些新的基因分型技术，可以从分子水平上分析不同地理区域流行的牛型分枝杆菌的特点、追踪传染源，对于了解牛结核分枝杆菌的生态分布与传播，以及时提出预警等，都具有重要的意义。目前国内外应用于结核分枝杆菌复合群基因分型方法主要分为两类：一类是以限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)为基础的方法[2]，另一类是以基因组中特定多态性区域序列进行PCR扩增为基础的方法，其中的间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, spoligotyping)分型方法已经被广泛用于牛结核分枝杆菌的分型，是第一个被认可的分型方法[2-6]。

我国目前的变态反应阳性牛均要求扑杀，但很多变态反应阳性牛并不能见到结核症状，且扑杀后没有明显的病变。根据我们前期的研究，牛结核变态反应试验在流行率较低的地区假阳性相对较多，而在流行率较高的地区则相对较少[7]。我们在前期工作的基础之上，分别扑杀在不同流行率地区检出的变态反应阳性牛并进行细菌分离，用多重PCR方法鉴定和spoligotyping方法分型，并评估这两种方法在不同地区的应用价值。

1 材料和方法

1.1 试剂和重要仪器 Taq DNA聚合酶(5U/μL)、PCR Master等购自于大连宝生物公司。DNA Marker 、EB(溴化乙锭)等购于Promega公司。Middle brook 7H11培养基，购自美国BD公司。Rnase A、蛋白酶购自大连宝生物公司。Spoligotyping 试剂盒购自Ocimum Biosolution，ECL 发光检测试剂购自Amersham International公司，亲核素—过氧化物酶连接液购自Boehringer公司。显影液和定影液均购自柯达公司。Mini-blotter MN45 为荷兰Isogen Life Science 公司产品。多重PCR引物Mycgen、 TB1 、Mycav、Mycint 4和spoligotyping引物DRa、DRb均由大连宝生物公司合成。多重PCR引物序列参考文献；DRa序列为5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，5′末端采用Biotin标记；DRb序列为 5′ -CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。

1.2 标准菌株 结核分枝杆菌标准株H37Rv、牛分枝杆菌标准株AF2122/97、BCG-Pasteur标准株、禽分枝杆菌标准株、胞内分枝杆菌标准株和草分枝杆菌标准株，均由北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫研究实验室提供。

1.3 疫区和非疫区结核阳性牛的剖检 地区1历史流行率高于2%的3个结核阳性牛牛场，共计114头牛，在检疫后发现23头阳性牛；来源于历史流行率低于0.5%的地区2的1个牛场，共计312头牛，经检疫后发现16头阳性牛。将阳性牛剖杀后检查病变，有病变的采集结核结节，无病变的采集淋巴结。

1.4 分枝杆菌的培养及染色鉴定 无菌条件下，采集结核病变，加入适量的灭菌生理盐水，经研磨器匀浆处理后，加入2倍体积的4%硫酸，室温下处理病料15～20 min。利用生理盐水再将处理过的病料做10倍稀释，用移液器分别接种0.2 mL至Middle brook 7H11 培养基。37 ℃培养6周，将扩大培养好的临床分离菌株和牛结核分枝杆菌标准株转移到密闭的含有生理盐水的试管中，将试管置于水浴锅，经80 ℃ 2 h灭活。用Ziehl-Neelsen(Z-N)方法染色，于显微镜下观察结果。

1.5 分离菌株的分枝杆菌多重PCR鉴定 以灭活的分离菌株作为样品，以牛分枝杆菌标准株作为阳性对照，用Mycgen、 TB1 、Mycav和Mycint 4对引物进行扩增，扩增出1 030 bp片段表明为分枝杆菌种，扩增出372 bp片段为MTC群(包括人分枝杆菌和牛分枝杆菌等)。如果只扩增出1 030 bp片段而没有372 bp片段则为非结核分枝杆菌。

1.6 spoligotyping鉴定分离菌株 采用Kamberbeek J推荐Spoligotyping方法并做适当改进[8]。

1.6.1 PCR扩增直接重复区(DR区) 用结核分枝杆菌标准株H37Rv、牛分枝杆菌标准株AF2122/97和BCG-Pasteur标准株的DNA为阳性对照，以DRa和DRb作为引物。对临床分离株的DNA进行PCR扩增。反应体系为2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物(10 pmol/L) 各2 μL、模板DNA 2 μL、双蒸水8.5 μL，总体积25 μL。反应程序为96 ℃预变性3 min，96 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s 30个循环，72 ℃延伸7 min。

1.6.2 PCR 产物的杂交与检测 将25 μL PCR产物加入到175 μL 2×SSPE/0.1% SDS中，100 ℃ 水浴10 min，取出立即放入冰上。用250 mL的2×SSPE/0.1% SDS在60 ℃洗杂交膜5 min，将杂交膜放入miniblotter , 并使狭缝和寡核苷酸的线型模型相垂直。将稀释的PCR产物填入狭缝，并用防水胶带将miniblotter密封，放置于60 ℃水浴锅的水平表面杂交60 min。洗膜并晾干放入保鲜袋中冷却，加入10 μL亲核素-过氧化物酶连接液42 ℃孵育60 min。洗膜后加入ECL液并曝光10 min、显影5 min，定影5 min，清洗胶片。

2 结 果

2.1 疫区和非疫区结核阳性牛的剖检结果 地区1的3个历史结核阳性牛场的共计23头阳性牛；其中群1剖杀9头，有6头有结核病变；群2剖杀11头，7头发现结核病变，群3剖杀3头，1头发现结核病变；采集结核病变或淋巴结至实验室进行细菌分离。其中部分病变见图1。地区2牛场检出的阳性牛共计16份，剖杀后未发现病变，采集淋巴结至实验室进行细菌分离。

A: Tubercle on lung of PPD positive cattle; B: Pearl-like tubercles on chest wall of PPD positive cattle.

图1 PPD阳性牛解剖后发现的结核病变

Fig.1 Tubercles formed in the chest of the skin test reactor

2.2 细菌分离结果 将结节内的干酪样坏死取出，或者将淋巴结匀浆后经酸处理，接种于Middle brook 7H11培养基。37 ℃培养6周，培养阳性者可见有不透明的颗粒状菌落生长，表面皱褶粗糙，呈乳白色结节状，阴性则无菌生长。结果地区1的23份病料中，14份病变组织中有9份分离到可疑菌，9份非病变淋巴结中有2份分离到可疑菌，从病料中分离到细菌的几率为47.8%(11/23)；地区2的16份病料中，4份分离到可疑菌，从病料中分离到细菌的几率为25%(4/16)。

2.3 分枝杆菌多重PCR鉴定结果 以灭活的分离菌株作为样品，以牛分枝杆菌标准株作为阳性对照，以草分枝杆菌作为阴性对照进行分枝杆菌多重PCR。反应结束后取5 μL产物进行1%琼脂糖电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察。结果阳性、阴性对照均成立，牛结核疫区的临床样品分离菌株同牛分枝杆菌标准株一样，引物MYCGEN-F和MYCGEN-R有1 030 bp片段扩增，引物TB1-F和TB1-R有372 bp片段扩增，而非结核疫区的阳性牛分离菌株则仅有1 030 bp片段扩增，没有372 bp片段扩增(见图2)。证实地区1的临床样品分离菌株属于MTC群，而地区2的临床样品分离菌株则为非结核分枝杆菌。

1: DNA Marker; 2:MycobacteriumbovisAF2122/97; 3:Mycobacteriumphlei; 4-7: Pathogens isolated from higher prevalence area were identified asM.tuberculosis-complex (MTC); 8-11: Pathogens isolated from lower prevalence area were identified as nontuberculoaus mycobacteria (NTM).

图2 污染牛群和非污染牛群结核阳性牛病料分离菌株的多重PCR鉴定结果

Fig.2 Multi-PCR identification of mycobacterium isolates from several areas of China

2.4 spoligotyping分型结果 应用spoligotyping分型技术对牛分枝杆菌临床分离株、结核分枝杆菌标准株H37Rv、牛分枝杆菌标准株AF2122/97和BCG-Pasteur标准株进行鉴定。其中结核分枝杆菌标准株H37Rv、牛分枝杆菌标准株AF2122/97和BCG-Pasteur标准株的杂交图谱与国际报道的标准一致。牛分枝杆菌临床分离株均缺失39～43之间的杂交，符合牛分枝杆菌的特点。

Spoligotyping可将临床分离的牛分枝杆菌分为4个基因型(见表1)。通过查询国际牛结核分枝杆菌spoligotyping数据库(http://www.mbovis.org/ spoligodatabase)，4个型中的2个型国外已有报道，分别为SB0140(世界范围内流行)[9-13]、SB1694(意大利有报道，参见数据库)；另有2个型国际上尚无报道，我们将这2个型的数据提交数据库，获取其统一编号为SB1903和 SB1904。SB1903型菌株Spoligotyping图谱缺失3、9、16、26、28和39-43号间隔区，SB1904型菌株Spoligotyping图谱缺失3、4、9、16、26和39-43号间隔区，其共同特点是缺失26号间隔区(牛结核分枝杆菌均缺失3、9、16、39-43号间隔区)，该特点可能是地区1流行的牛结核分枝杆菌菌株特征。

3 讨 论

3.1 多重PCR和Spoligotyping在我国牛结核监测中的应用价值 我国应用较多的牛结核病检测方法(颈部变态反应)的特异性较低(88.8%～100%)，国际上已被认可的γ干扰素试验仍然具有较高的非特异性(3.4%)[14]，用这些方法监测牛结核病会产生很高的非特异反应，因此必须联合使用细菌的分离与鉴定方法(特异性100%)才能提高监测的准确性。但由于细菌分离鉴定过于繁琐，常规的生化试验如噻吩-2羧酸肼培养基生长试验、硝酸还原试验和烟酸试验等方法复杂，需时较长，且具有生物风险，在我国牛结核监测的实践中很少有应用。国际上病原鉴定中广泛应用的多重PCR方法和spoligotyping方法在我国的应用极少，本实验尝试联合应用这两种方法鉴定牛结核分枝杆菌，简便快速且能进行分子流行病学分析，促进我国牛结核病监测的范围和准确性提升。

3.2 流行率不同地区的分离菌株的不同 地区1(流行率较高地区)一共23头牛，扑杀后有14头有病变，共有11头牛分离出可疑菌，经多重PCR鉴定均为牛结核分枝杆菌；而地区2(流行率较低地区)扑杀16头牛，均没有发现病变，细菌分离仅有4份病料分离出非特异性分枝杆菌。本实验在牛结核流行率较高的地区，变态反应阳性牛扑杀后发现病变的几率(60.9%)，以及从病料中分离到可疑菌的几率(47.8%)，高于流行率较低地区(分别为0%和25%)。这也从侧面证实，在牛结核清净地区的检疫过程中，会产生较高的假阳性或者是非特异性分枝杆菌感染。这与我们前期的试验结果一致且与理论相符，即在流行率较低的地区进行监测，检测出来的阳性有很大一部分为非特异性反应，按照国标方法扑杀后必须要进行细菌分离与鉴定等工作以增加监测的准确性。

3.3 spoligotyping的应用价值 Spoligotyping在我国的应用较少，本次调查，发现地区1流行的主要菌型为SB1903。但其在独特菌型在地区1优势流行时，试验涉及的3个牛场，均分离出了SB0140型菌，证实这株国际上广为流行的菌株，也分布于该地区。证实该地区的菌株分布呈现出“独特菌型地域内相互传播为主、输入性感染为辅”的特征。随着国内牛结核分枝杆菌分离菌株的增多，不同地区将呈现出其当地的独特型菌株分布。因此，根据不同地区不同牛分离菌株的spoligotyping分析结果，就可以追溯传染源，并从分子水平上展开预警分析。

3.4 SB0140型牛分枝杆菌的公共卫生意义 SB0140型牛分枝杆菌广泛分布在英国、澳大利亚、新西兰、加拿大等世界范围内，而且在这些国家的分离菌株中占有很大比例[9]。如Joanne McLernon[10]等对爱尔兰的386株细菌进行spoligotyping分型，结果SB0140型约占50%；[11]等对来自于阿根廷、巴西、智利、墨西哥和委内瑞拉的1 684株牛结核分枝杆菌进行spoligotyping分型，结果SB0140所占比例最大，为24.6%。更值得关注的是，SB0140 具有重要的公共卫生意义。Olabisi Ojo[12]等报道，1998-2006年501位爱尔兰人患者，有15位(3%)为人感染牛结核分枝杆菌， 分离的11株细菌中3株(27%)为SB0140型。Timothy C. Rodwell[13]等对美国的106例人感染牛结核分枝杆菌进行调查，91%的感染人的牛结核分枝杆菌spoligotyping分型结果与感染墨西哥牛的分枝杆菌分型结果一致，证实加州南部的牛结核分枝杆菌感染人病例与墨西哥牛相关，而这106人中有39人(36.8%)的牛结核分枝杆菌分型结果为SB0140型。本次在我国也发现了SB0140型在牛群中的感染，但至于该型菌是否存在于我国人的感染病例中，尚需进一步研究。SB0140型牛结核分枝杆菌的分离与鉴定，很显然具有重要的公共卫生意义。

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Application of multiple-PCR and spoligotyping for investigation ofbovine tuberculosis from different epidemic areas

ZHANG Xi-yue1,FAN Cheng-xiang2,DU Peng-fei1,CAO Rui1,HU Xi-dan3,WANG Shu-juan1,FAN Wei-xing1

(1. China Animal Health & Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;2.Rizhao Animal Disease Control Center, Rizhao 276800, China；3.Veterinary Research Institute，Animal Science Academy of Xinjiang，Wulumuqi 830000，China)

To characterize theMycobacteriumbovisin the different epidemic areas, we combined the multiple-PCR and spoligotyping to investigate the bacteria isolated in the bovine tuberculosis surveillance. The bovine PPD skin tests were performed in lower-prevalence and higher-prevalence areas in China. The positives were slaughtered and their carcasses were examined for the tubercles. Isolated pathogens were identified by using multiple-PCR and then genotyped by using spoligotyping. No lesion was found from the carcasses of 16 positives in the lower-prevalence area. The 4 strainsMycobacteriawere isolated from the lymph nodes collected from the positives and then identified as nontuberculosisMycobacteriaby using multiple-PCR. The 23 positives were slaughtered and examined in the higher-prevalence area. The lesions were found from 14 cattle and then the pathogens were isolated from the 11 of them. The bacteria were identified asMycobacteriumbovisby using multiple-PCR. Totally, 4 spoligotypes were classified and 2 of them were new types. Number SB1903 and SB1904 were given after the patterns were submitted to the bovine tuberculosis spoligotyping database. It was revealed that the character of "domestic typing SB1903" was predominant but the world-spread typing SB0140 still be insistent in the area. It suggests that the scientists should pay attention on the transmission of the typing SB0140 to human beings as the typing has been found from cattle in China.

bovine tuberculosis; multiple-PCR; spoligotyping

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.010

范伟兴，Email:fwxsjl@126.com

1.中国动物卫生与流行病学中心,青岛 266032； 2.山东日照动物疫病预防控制中心，日照 276800； 3.新疆牧科院兽医研究所,乌鲁木齐 830000

R378

A

1002-2694(2015)04-0340-05

2014-02-14；

2014-10-20

科技基础性工作专项(2012FY111000)，现代农业(奶牛)产业技术体系建设项目(CARS37)