尼帕病毒的诊断技术研究进展

（贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 555000）

尼帕病毒的诊断技术研究进展

吴玙彤，谢丽丽

（贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 555000）

尼帕病毒病是严重危害人类与养猪业的一种较新的人畜共患病。文章中着重阐述了近年来在其实验室诊断技术方面的研究进展，以期为该病的深入研究提供参考。

尼帕病毒；猪；实验室诊断

尼帕病毒病(NVD)是由尼帕病毒引起的一种新的人畜共患病毒性疾病，于1997年在马来西亚森美兰洲双溪尼帕城首次发现[1]，是继疯牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各国广泛关注和恐慌的人畜共患病。生猪感染该病毒后，出现发热、呼吸困难及脑炎症状；母猪感染该病毒后表现为共济失调等神经症状，可能会导致流产或突然死亡；人感染该病毒后发生病毒性脑炎而死亡[2]。由于其引起人感染后的高死亡率，缺乏有效的疫苗和治疗方法，因此世界动物卫生组织(OIE)和我国农业部都将其列为生物安全4级病原体。

1 概况

尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒属(Henipavi rus)的尼帕病毒(NiV)引起的一种人畜共患传染病。NiV是新发现于蝙蝠的一种副黏病毒，1999年3月初，从Sungai Nipah村1名脑炎患者的脑脊液中分离到了一种新的副黏病毒，并确定为该次暴发的病原，因此命名为尼帕病毒(Nipah virus)[3]。血清学检测显示，家养动物如狗、猫、马和山羊均可感染尼帕病毒，但猪是其他家养动物的传染源[4]。尼帕病毒可感染不同年龄的猪，从1998年马来西亚暴发尼帕病毒病以来，已造成许多人和猪伤亡，引起了巨大的社会恐慌，并给养猪业造成严重的经济损失。

2 实验室诊断技术

2.1 病原学检测

2.1.1 NiV分离鉴定

NiV能够在多种培养细胞中生长并快速增殖至较高的滴度。非洲绿猴肾细胞和兔肾细胞RK-13细胞系对NiV尤为敏感。通常在病毒感染3 d内能够观察到病毒病变效应(CPE)，但一般来说在细胞上传代2次，每次5 d所达到的分离效果更为稳定。经低毒量稳定传代后的病毒再次感染细胞后24～48 h，细胞出现以形成合胞体为特征的CPE，并且感染早期，合胞体中所有细胞核位于合胞体中央，而晚期则被运送至合胞体外，并聚集在其周围[5]。由于NiV在体外细胞培养中扩增迅速，并且能产生大量的病毒抗原，所以采用免疫荧光或免疫电镜法检测分离培养该病毒，最为方便快速。

2.1.2 分子诊断技术

NiV的基因组全序列已被测出[6]，研究者们可以在此基础上针对NiV的分子诊断技术进行相应的研发。目前，已经被报道的针对NiV的分子检测技术有2种，分别为荧光定量RT-PCR和双重套式RT-PCR。

2.1.2.1 荧光定量RT-PCR

该方法敏感度高、特异性强，并且不需要接触活的感染性病毒，具有生物安全性的优势。其检测灵敏度可以达到1个空斑形成单位 （PFU）[7]，并且有被学术界普遍认可的相关引物和探针有：

5′－TCAGCAGGAAGGCAAGA GAGTAA－3′（Primer1），

5′－CCCCTTCATCGATATC TTGATCA－3′（Primer2），

5′－6FAM－CCTCCAATGAG CACACCTCCTGCAGTAMRA－3′（TaqMan probe），为NiV的实验室快速诊断提供了技术支持。

2.1.2.2 双重套式RT-PCR：

Wacharapluesadee等描述了一种带有内参的双重套式RT-PCR检测技术。该技术能够用于对果蝠尿样的检测，并且加入内参大大降低PCR相关的抑制因素带来的假阴性的结果，提高检出准确率，在NiV流行病学调查时大大提高NiV监测数据的可靠性。

2.1.3 其他诊断技术

主要针对NiV全病毒抗原或病毒主要致病抗原（如F蛋白和G蛋白等）制备特异性的病毒抗血清或单克隆抗体，在此基础上建立病毒中和试验、免疫组化以及免疫荧光等方法检测NiV相关抗原。病毒中和试验主要包括传统的空斑抑制试验、微孔板中和试验以及免疫空斑试验3种，分别通过计算空斑形成单位（PFU）、组织培养半数感染量（TCID50）以及病灶形成单位（FFU）达到检测病毒抗原或抗体的目的。检测NiV的病毒中和试验需要在BSL4级生物实验室进行，但近年来研究者们陆续开发了几种实验室检测技术，能够将检测NiV的生物安全水平降低至BSL2级，为偏远地区NiV检测提供了帮助。由于NiV原发于血管内壁，所以病死畜的多个器官均可用于免疫组化的检测，尤其是肺脏。

目前，研究者们已经针对NiV的免疫组化法检测研发了几个检测体系，为该病毒的实验室检测提供了技术支持。

2.2 血清学检测

鉴于NiV的生物危害性，用于该病毒血清学诊断的所有血清样品必需进行安全化处理，以尽量减少实验室工作人员接触NiV的风险。可以用6 kGy的γ射线辐照或含0.05% Tween20和0.5% Triton—X100 PBS（磷酸缓冲液） 1/5 稀释后56 ℃ 30 min灭活的方法对血清样品进行前处理。目前常用的NiV的血清学检测方法包括病毒中和试验和ELISA试验。

2.2.1 病毒中和试验

目前针对NiV抗体检测的病毒中和试验已经有相关的标准方法，Kaku等人利用基因重组技术构建了共表达NiV F或G蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的重组水泡性口炎病毒，作为已知病毒抗原检测NiV血清样本，用该重组病毒作为已知病毒抗原的好处在于GFP是可见的，可以在荧光显微镜下直观地数出荧光斑点的数量而获知血清样品中NiV特异性抗体的含量。该方法要比传统的中和试验更为迅速、安全和灵敏。Tamin同样也利用基因重组技术构建了单独表达F或G蛋白的重组水泡性口炎病毒作为已知抗原，检测NiV抗体，并在此基础上建立了检测NiV抗体的空斑抑制试验。

2.2.2 ELISA

目前，针对NiV抗体检测的ELISA技术已经开发出间接ELISA和捕获ELISA 2种。Daniels在1999年召开的国际猪病监测会议中提出了一种用非离子去污剂处理NiV感染的细胞以获得ELISA检测用NiV抗原的方法，随后，为消除ELISA的非特异性，研究者们又在此基础上加入了非感染细胞作为对照。美国疾病控制中心开发出能够检测针对NiV IgG和IgM 2种亚型免疫球蛋白的ELISA技术。此外，Yu等人也报道过用NiV N蛋白作为病毒抗原检测IgG和IgM 2种亚型免疫球蛋白的ELISA方法。

3 防控措施

目前对该病尚无有效的药物和治疗方法，只能采取强制措施，监测并淘汰患病动物，以免传染给人；防止家猪与野猪的接触；禁止运输和进口患病猪及其肉制品；对猪舍进行消毒，搞好清洁卫生工作。人感染后，用广谱抗病毒药Ribavirin(利巴韦林)，可减少发烧时间，缓解发病程度，降低急性脑炎死亡率。随着科学家对这一病原的不断了解，人们利用疱疹病毒为载体进行F、G融合蛋白克隆，并在大肠杆菌中进行表达，有可能用来防治尼帕病毒的感染，其他相关的疫苗正在研究开发中。

[1] 陈继明，王志亮，赵永刚，等.2004年孟加拉尼帕病毒病疫情简介[J].中华传染病杂志， 2005，23(2)：144.

[2] 包世俊，扈荣良.猪的副黏病毒病简介[J].中国兽医科技，2002，32(10)：44-46.

[3] Chua K B，Goh K J，Wong K T，et al.Fatal encephalitis due to nipah virus among pig farmers in malaysia[J]. Lancet，1999(354)：1257-1259.

[4] Tan K S，Tan CT，Goh K J.Epidemiological aspects of Nipah virus infection[J].Neurol J Southeast Asia ，1999(4)：77-81.

[5] Hyatt A D，Zaki S R， Goldsmith C S，et al.Ultrastructure of Hendra virus and Nipah virus within cultured cells and host animals[J].Microbes and infection，2001，3(4)：297-306.

[6] Wang L，Harcourt B H，Yu M，et al.Molecular biology of Hendra and Nipah viruses[J].Microbes Infect，2001(3)：279-287.

[7] Guillaume V，Lefeuvre A，Faure C，et al.Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR(TaqMan)[J]. J Virol Methods，2004(120)：229-237.

；2015-09-17)