猪干扰素的研究进展

卓秀萍，朱 玲，徐志文

(四川农业大学动物生物技术中心，四川 成都 611130)

猪干扰素的研究进展

卓秀萍，朱 玲*，徐志文

(四川农业大学动物生物技术中心，四川 成都 611130)

近年来，猪病的流行严重地制约着我国养猪业的发展，并造成巨大的经济损失；病毒感染、寄生虫感染等是造成猪只发病的主要原因。虽然已有各种疫苗得到广泛应用，但仍不能有效控制疾病的流行，研发高效、安全的猪病防治制剂成为迫切的需要。干扰素(Interferon， IFN)通过激活细胞中多种功能基因的转录，调节各信号传导通路的协同作用，能够发挥抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、免疫调节等多种生物学功能；此外IFN还具有广谱性和种族特异性，对健康的细胞无毒，使用安全[1]。通过研究发现，猪干扰素(Porcine Interferon， PoIFN) 对体外抑制多种病毒、寄生虫的增殖已初见成效，对治疗细菌、病毒的混合感染也比较有效，因此研究PoIFN对猪病的防治具有积极的现实意义。目前市场上使用最多的PoIFN是猪白细胞干扰素，其于1997年获得我国农业部“新兽药证书”、“生产批准文号”，于1999年获得国家“发明专利证书”[2]。此外，实验室正在尝试构建动物PoIFN基因重组疫苗，其对提高产量、增强免疫效力、降低病毒载体毒性等方面都有重要的意义。

1 分类与来源

IFN是受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白，正常情况下IFN基因处于被抑制状态，在有诱导剂的条件下解除抑制而获得表达。诱导剂包括病毒或者核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等，此外现代中药研究证实知母、板蓝根等也可诱导IFN生成。由于与人IFN相似，根据序列同源性以及信号转导受体复合物的不同，PoIFN可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型包括PoIFN-α、β、δ、ω、τ、κ；Ⅱ型只有PoIFN-γ；Ⅲ型为PoIFN-λ，也可细分为PoIFN-λ1、λ2、λ3；其中Ⅰ型PoIFN对酸的耐受性最大，抗病毒作用最强。目前为止研究比较多的主要为PoIFN-α、β、ω和PoIFN-γ。

2 生物活性

2.1 广谱抗病毒作用

与人的IFN相同，PoIFN主要通过间接地抑制病毒的增殖来发挥抗病毒作用。病毒的感染导致细胞产生PoIFN；PoIFN又随被感染细胞的死亡和崩解而释出，并随血液循环到达全身。之后PoIFN与猪体内细胞膜上敏感受体结合，诱导该细胞转录出五种抗病毒蛋白（Antiviral Protein，AVP），分别为双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR，常称为P1/eIF-2A）、2'，5'腺苷酸合成酶（2'，5'-Oligoadenylate synthetase，OAS）、腺苷脱氨酶I（Adenosine deaminase 1，ADAR1）、GTP结合蛋白（Mx蛋白）、氮氧化物合成酶（Nitric oxide synthease，NOS），并分别发挥抗病毒作用。当猪遭受病毒攻击后，如果病毒还未在细胞内大量生长繁殖，可立即使用PoIFN，以保护正常细胞；但如果机体大部分细胞都遭受病毒攻击并遭到严重破坏时，即使注射PoIFN也不能产生足够的AVP以保护细胞；因此在临床应用上应尽早用药[3]。

2.2 抗寄生虫作用

PoIFN主要通过加强细胞毒效应和降低细胞的活性来发挥它的抗寄生虫活性作用。CD8+T细胞能够识别利什曼原虫、弓形虫等特异性组织相容性复合物Ⅰ(MHCⅠ)类抗原，并产生PoIFN；研究结果表明PoIFN通过激活MΦ来诱导氧自由基攻击脂质膜与NO抑制靶细胞的DNA合成和线粒体的呼吸作用，从而破坏寄生虫体并导致病原体活力下降，寄生虫死亡[4]。同时PoIFN还能够诱导靶细胞内池的色氨酸降解，从而抑制寄生虫繁殖。相比于所有PoIFN，PoIFN-γ抗寄生虫活性最强。

2.3 抗细菌作用

PoIFN主要是抗胞内菌，其主要通过诱导靶细胞转录出来的GBP1蛋白，这是一种GTP结合蛋白。胞内菌通过吞噬体进入细胞，其后续通过特定途径进入细胞质进行复制。研究发现GBP1发挥抗胞内菌的机制是增强氧化杀伤能力及促进运送抗菌肽至自噬体而发挥杀菌效应；此外还通过下调转铁蛋白受体，减少细菌供铁或诱导产生内源性NO直接抑制细胞内细菌等，而且该机制使得GBP1具有广谱抗胞内菌的能力。

2.4 免疫调节作用

PoIFN可增加IgG的Fc受体表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，K细胞、NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力；但剂量过大会起抑制作用。I型的免疫调节作用比II型强，两类PoIFN的协同调节作用使机体处于最佳免疫应答状态[5]。

2.5 其他生物学作用

PoIFN除了以上主要功能外，还有其他一些功能：如对妊娠的识别及维持作用、抗肿瘤作用、抗增殖活性等。PoIFN-τ作为一种早期怀孕信号，在胚泡附植前后产生，可能通过抑制子宫内膜对催产素的敏感性、降低前列腺素的活性、阻止黄体溶解，以达到维持妊娠的作用识别阶段[6]；此外，妊娠识别过程中也产生一种特征性的分泌蛋白，研究发现其结构类似PoIFN-τ，但其具体作用机制有待进一步研究。PoIFN抗肿瘤主要表现在抑制肿瘤的增殖、抑制肿瘤细胞增生、改变瘤细胞表面的性能以易于被免疫监视细胞识别和排斥、通过免疫调节来增强机体抗肿瘤能力等。PoIFN-α还能针对细胞周期控制体中的特异因子发生作用，包括通过作用于c-myc、Prb、D3和cdc25A蛋白来抑制细胞的增殖。

3 对猪病的防治

3.1 抗病毒

IFN由于抗病毒具有广谱性和安全性，被誉为最有希望治疗病毒病的“青霉素”。造成猪只发病的病毒性病原主要有口蹄疫病毒(FMDV)、蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒 (PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪传染病胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(RV)等。研究表明，PoIFN对以上病毒均有良好的抑制效果，因而越来越受到国内外学者的青睐。早期的研究主要使用猪白细胞PoIFN防治猪病[7]；随着研究的深入，重组干扰素得到了广泛地研究，通过毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、腺病毒、杆状病毒、家蚕杆状病毒等载体，成功表达并得到纯化出rPoIFN-α、rPoIFN--β、rPoIFN-γ、rPoIFN-ω[8-11]，为体内和体外抗病毒的研究提供了重要的材料。

3.2 抗寄生虫

马良等(1995)[6]在人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的培养中加入过量的色氨酸能完全抑制IFN-γ、IFN-α介导的抗弓形虫病作用。潘晓梅等（2008）[12]利用重组PoIFN-γ进行体外抗弓形虫感染，发现随着IFN-γ剂量的增大，巨噬细胞的抗弓形虫作用逐渐增强；为利用PoIFN-γ预防弓形虫提供了良好的方向。

3.3 治疗多种病原体混合感染

张真等用PoIFN与阿莫西林、黄氏多糖联合用药，治疗已感染猪链球菌、副猪嗜血杆菌、PCV2的病猪，阻止了病情的蔓延，疗效显著。张泉军等(2005)通过实验和临床扩大试验发现猪白细胞IFN对哺乳仔猪和断奶仔猪某些病毒性腹泻、细菌性腹泻、病毒和细菌混合感染引发的腹泻，均有良好的预防和治疗作用。龙庆军等（2008）采用PoIFN-α治疗混合感染了PRRSV、附红细胞体病、链球菌的猪，结果显示病猪的病情明显好转。

3.4 免疫佐剂作用

20世纪80年代初细胞因子开始作为佐剂得到运用，IFN具有较强的佐剂活性，并且对降低副反应也有一定的功效。研究发现以重组PoIFN-γ为疫苗佐剂，不仅能特异性地增强疫苗的免疫效果，而且可增强机体抗感染的能力。窦永喜等（2004）研究发现PoIFN-γ对猪囊虫全虫疫苗有良好的免疫佐剂作用，优于传统使用的铝盐和206佐剂。马凤龙等（2005）实验证明了不同剂量的重组PoIFN-γ分别与猪瘟兔化弱毒苗、猪蓝耳病弱毒苗和伪狂犬弱毒疫苗联合应用，可提高血清抗体水平，增强疫苗的免疫效果。章红兵（2013）研究发现在PCV2免疫时联合PoIFN可以发挥协同作用，增强免疫效果，但与PoIFN的剂量有一定关系。

3.5作为饲料添加剂

IFN胶囊及纳米可以通过药物释控技术与特殊载体结合，作为保健型饲料的药物添加剂。岑路（2010）等通过PoIFN-α在促进生长作用和预防病毒性疾病方面的临床试验表明，PoIFN-α对仔猪的生长有良好的促进作用，具有显著的紧急预防病毒性疾病的效果。

4 基因工程

正常情况下动物体内IFN表达量很少、难以提取和纯化，因此在临床生产中首先考虑高效的基因工程技术。通过基因工程生产的PoIFN最开始在大肠杆菌上表达，随着提取工艺的不断完善，目前PoIFN蛋白提取率可达95%～97%；另3%～5%是大肠杆菌杂蛋白，副作用较大，易引起使用对象发热、发烧、过敏等不良反应。为了表达出高效、廉价、副作用小的重组PoIFN，科研工作者们还尝试了在酵母菌、杆状病毒、腺病毒等中表达PoIFN，并获得了成功。从毕赤酵母中表达和纯化PoIFN-α效价高、毒素含量低，更类似于天然结构的特点。在腺病毒上表达和纯化PoIFN，表达产物具有正确的活性，而且副产物少，易于纯化和减少副作用；同时由于缺陷型腺病毒的强力穿透、直达已感染的细胞内，使药效更长久，增强PoIFN的使用效果。重组PoIFN最理想的剂型为IFN的聚乙二醇化(Pegylated，PEG)和IFN与载体脂质体(Liposome-IFN)的结合，这两种是剂型能很好的延长IFN在体内的半衰期、增加其稳定性、降低免疫源性。PoIFN基因工程的发展不但为PoIFN的大量生产提供了新的方向，而且大大丰富了对PoIFN遗传结构和化学组成的认识，并可以阐明PoIFN的组成和功能的关系，有利于探索特殊功能的PoIFN。PoIFN基因工程的进一步研究对构建动物IFN基因重组疫苗，提高其免疫效力，降低病毒载体毒性等方面有着重要的意义。

5 存在问题

研究认为在兽医临床上PoIFN对畜禽机体副反应一般比较轻，但随着浓度的增加和疗程的延长，肌注可能引起发热、红斑及疼痛。由于PoIFN在治疗畜禽疾病主要还处试验阶段，具体的毒副作用并未完全显现出来。目前影响PoIFN临床运用的除了毒副作用外，还主要存在以下问题：第一，目前不同PoIFN的组织亲和性和生物学作用亦有待深入研究和了解。第二，PoIFN的提纯和测定方法尚不够稳定和简化。第三，使用PoIFN治疗同一疾病的疗效并不一致，所以一般需用较大剂量，且疗效呈剂量依赖性，但随着剂量的增加毒副作用也增加。第四，重组PoIFN在治疗过程中有时会产生抗体，如果发现抗体产生，应改用其他亚型的PoIFN。第五，在猪的治疗主要局限在试验阶段，其与不同药物最佳配伍等问题需探索。

6 展望

随着新病原株、变异株的不断出现，目前许多药物对某些猪病已经难以显示出满意的防治效果。大量研究证明PoIFN对威胁重大的多种猪病均具有良好的防治作用，给猪病防治提供了新的手段，有望创造巨大的经济效益和社会效益。传统生产PoIFN有成本高、产品质量难控制及临床疗效不稳定等问题；建立规模化生产体系、利用基因工程技术生产重组PoIFN是一条十分有效途径，但对于其中一些关键技术问题如PoIFN的表达水平、高密度发酵工艺、生物学活性以及临床应用方法等诸多环节仍需进行深入研究。大量试验证实PoIFN与牛、羊等动物之间存在交叉活性，PoIFN不仅对猪病疗效良好，对牛病毒性腹泻、小鹅瘟、羔羊腹泻等都具有不错的疗效，研究PoIFN对防治牛羊等动物的疾病也具有积极的意义。此外，将生产的PoIFN作为增强剂，与不同的疫苗联合应用或与保护性抗原基因融合表达，可以增强疫苗的免疫效果，将对猪病防治产生积极的影响。另外，中药诱生IFN也已成为广大学者关注的热点之一。PoIFN的临床治疗效果已经得到各界专家的肯定，基于其广阔的发展前景，PoIFN值得我们进一步关注和研究。

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2015-07-22）

四川省2014年科技支撑计划（2014NZ0043）

卓秀萍（1990-），女，四川成都人，硕士生，研究传染病方向

朱玲（1972-），女，四川会东人，教授，博士，硕士生导师，研究动物传染病病原分子生物学方向