蛋白质二硫键异构酶A3——疾病治疗的新靶点*

胡　玥，陶丽媛，吕　宾(浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江杭州310006)



蛋白质二硫键异构酶A3——疾病治疗的新靶点*

胡玥，陶丽媛，吕宾△
(浙江中医药大学附属第一医院消化科，浙江杭州310006)

PDIA3: a new therapeutic target of diseases

HU Yue，TAO Li-yuan，LBin
(Department of Gastroenterology，First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China.E-mail: lvbin@ medmail.com.cn)

［ABSTRACT］Protein disulfide isomerase A3 (PDIA3) is a member of protein disulphide isomerase family and widely exists in endoplasmic reticulum，cell surface，nucleus and mitochondria.PDIA3 promotes the glycoprotein folding and quality control in the endoplasmic reticulum and is also a key molecular of major histocompatibility complex class I molecules assembly.In addition，PDIA3 is involved in the cell signal transduction and plays an important role in a variety of disease development.Therefore，this paper talks about the function of PDIA3，the relationship between disease and PDIA3 as well as its clinical outlook.

［关键词］蛋白二硫键异构酶A3

［KEY WORDS］Protein disulfide isomerase A3

［修回日期］2015-04-03

蛋白质二硫键异构酶A3 (protein disulfide isomerase A3，PDIA3 )，又称ERp57或ERp57/GRP58，是蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)家族的一员，具有催化内质网中蛋白质二硫键形成、氧化还原及异构化的作用。Bennett等［1］于1988年首次从不同物种中分离出PDIA3基因的互补DNA编码链，诸多研究显示其氨基酸序列与PDI有高度相似性，具有PDI活性，遂将其归为PDI家族。

PDIA3蛋白由位于15号染色体上的PDIA3基因编码而成，结构存在高度复杂性，由505个氨基酸构成，最初的24个氨基酸构成了信号肽;蛋白分子量为58 kD，由4个硫氧还蛋白结构域构成，分别称为a、b、b’和a’，与硫氧还蛋白相似，有特有的α螺旋和β折叠［2］。

人类PDIA3的mRNA在肝、肺、胎盘、胰腺和肾脏中表达最高，在心脏、骨骼肌和大脑中表达最低，表达量的高低存在动态变化，如骨髓间充干细胞中的PDIA3基因表达量随着细胞衰老而下降［3］。PDIA3主要分布于细胞内质网(endoplasmic reticulum，ER)腔，也因此获得别名ERp57，但其在细胞表面、细胞核和线粒体等不同部位也广泛存在，各自发挥不同的作用。

1 PDIA3的功能

1.1在内质网中的作用内质网是PDIA3发挥作用最重要的场所。作为重要的分子伴侣，PDIA3和钙联接蛋白、钙网蛋白组成复合物共同促进细胞新合成的糖蛋白在内质网中正确折叠，并进行质量控制。使用小干扰RNA干预成纤维细胞中PDIA3的表达，可影响内质网中新生糖蛋白翻译后折叠［4］。同时，PDIA3参与主要组织相容性(抗原)复合物I (major histocompability complex I，MHC I)类分子的组装，以二聚体的形式与MHCI重链、β2-微球蛋白、钙网蛋白、抗原转运相关蛋白等一起组成肽加载复合物(peptide-loading complex，PLC)，使抗原结合沟槽更适合抗原肽，在适应性免疫应答的内源性抗原提呈中发挥重要作用。Garbi等［5］对小鼠B细胞进行PDIA3基因敲除，发现B细胞的发育、增殖以及抗体的分泌均未受影响，但出现PLC的组装异常，影响抗原提呈。另外，蛋白质组学分析提示包括PDIA3在内的多种内质网相关蛋白是吞噬体的组成成分，介导巨噬细胞的吞噬作用［6］，可见PDIA3亦是固有免疫的重要参与者。Schelhaas等［7］指出，当完整猿猴病毒从细胞表面通过内吞作用进入内质网后，衣壳蛋白被PDIA3解离，释放入细胞质，继而进入细胞核。

大量研究发现，多种疾病的发生发展过程中存在内质网腔内多种应激蛋白上调，这种内质网应激现象与急性肺损伤、纤维增生性急性呼吸窘迫综合症、H1N1导致的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重密切相关。PDIA3作为内质网腔中的氧化还原酶，在内质网应激过程中发生上调。甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)能引起内质网的应激，上调PDIA3，而PDIA3的减少会降低病毒的侵害，降低caspase-12的激活和上皮细胞的凋亡［8］。而代谢综合征患者餐后脂肪组织的内质网应激可以平衡进餐引起的应激［9］。

1.2在内质网外的作用Hirano等［10］首次观察到3T3细胞分泌PDIA3，随后的研究证实PDIA3存在于多种细胞表面或细胞膜蛋白复合物中。PDIA3和维生素D受体相互依存，和微囊蛋白1共同定位于MC3T3-E1成骨细胞，共同介导细胞对于1α，25 (OH)2D3的反应，调节细胞的生物学功能［11］。PDIA3有核定位信号序列(nuclear location sequence，NLS)，能从细胞质中进入细胞核，改变靶基因的转录。对肝癌细胞株HepG2进行TNF-α干预后，细胞质中的PDIA3在15 min内移位到细胞核［12］。细胞核中的PDIA3与DNA和核蛋白相联，Aureli等［13］在HeLa细胞株和黑色素瘤细胞中发现有相同的DNA序列，能在应激反应时与PDIA3特异性结合，而通过RNA干扰使PDIA3基因沉默后，此段DNA序列表达下调，提示PDIA3可能调节靶基因的转录和DNA的修复。线粒体中的PDIA3能保护线粒体钙蛋白酶，抵抗其它线粒体蛋白酶对其降解;同时，PDIA3与钙蛋白酶的复合物能催化凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)的部分降解，使之从线粒体膜释放入细胞质，从而参与凋亡过程［14］。

综上所述，PDIA3在内质网中通过各种途径参与蛋白质的加工处理、MHCI类分子的组装、固有免疫应答、适应性免疫应答的抗原提呈，以及内质网应激的过程。而其在内质网外，广泛分布于多种细胞表面及细胞膜蛋白复合物，则能参与调节MC3T3-E1成骨细胞的生物学功能;进入细胞核后参与靶基因转录和DNA修复;线粒体中的PDIA3能对抗线粒体降解，参与细胞凋亡。PDIA3通过在内质网内外的各种功能共同介导了众多疾病的发生与发展。

2 PDIA3相关疾病

2.1肠易激综合征PDIA3在肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)中表达上调。应用差异荧光双向凝胶电泳技术进行IBS大鼠结肠差异蛋白筛选，发现19个差异蛋白点，并对筛选出的差异蛋白进行鉴定，发现IBS大鼠结肠黏膜组织中PDIA3蛋白表达显著高于对照组［15］。我们前期研究［16］用Western-blot检测15例腹泻型IBS(IBS-D)患者结肠黏膜组织中PDIA3蛋白的表达水平，发现显著高于健康对照组，同时，检测到IBS-D患者结肠组织中的类胰蛋白酶浓度明显高于对照组，且PDIA3与类胰蛋白酶浓度呈正相关。PDIA3极有可能在IBS的发病中发挥重要作用。

2.2肝脏疾病PDIA3在不同肝脏疾病中表现出不同的变化。因长期酗酒导致肝损伤的患者，其PDIA3表达下调，导致蛋白质折叠异常，引发肝毒性，是酒精性肝损伤的分子标志［17］。而在非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患者的肝活检组织中，以及游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)诱导的脂肪肝细胞中均发现PDIA3蛋白表达上调，PDIA3的表达与NAFLD患者的炎症程度和纤维化程度有关;用siRNA干扰脂肪细胞中PDIA3的表达能显著减少脂肪堆积，提示PDIA3可能通过影响脂肪转运及代谢参与NAFLD发病［18］。

2.3气道高敏感PDIA3在气道过敏性疾病中起显著作用。采用屋尘螨作为变应原在体外和体内对人类与小鼠的气道初级上皮细胞进行应激，可以诱导内质网应激，激活转录因子α6(activating transcription factor α6，ATF6α)以及PDIA3，关联性激活caspase-3;而对ATF6α和PDIA3基因敲除小鼠进行屋尘螨刺激，则可诱导内质网应激，减少二硫键介导的寡聚化和caspase-3的激活;同时，炎症、气道高反应性及气道纤维化的发生率也相应降低。所以，PDIA3在屋尘螨诱导的气道过敏性疾病中发挥了重要作用，抑制内质网应激反应可能为慢性哮喘和与肺功能丧失相关性上皮间质化提供一个潜在的治疗途径［19］。

2.4肾脏疾病PDIA3与肾脏纤维化有关。肾脏细胞在转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)、血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)或血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)刺激下，引起保护性的未折叠蛋白效应通路激活，从而导致内质网应激效应，并分泌大量的PDIA3，引起细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的分泌和积聚而造成肾纤维化。无论是患者组织活检及动物模型，均提示肾纤维化与内质网应激这两者的程度和PDIA3的分泌量呈正相关。若敲除PDIA3基因或使用抗PDIA3抗体，则能破坏细胞外基质的纤维化进程。另外，有研究发现PDIA3在慢性肾脏病的早期就有分泌，而它在小便中的含量高低也与肾纤维化的程度呈线性相关，所以PDIA3有可能是肾纤维化发生与发展的标志之一［20］。

研究显示在肾移植发生急性排斥反应时，PDIA3在血清和移植肾中的基因和蛋白表达水平均升高，并伴随着血浆中IL-2、IL-4、IL-6和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平的升高，提示PDIA3可能参与肾移植急性排斥反应，而升高的IL-2、IL-4、IL-6 和CRP起保护性作用［21］。

2.5血小板聚集与血栓形成血小板中的PDIA3能调节血小板的聚集。使用PDIA3的拮抗剂，或给小鼠注入非活化的PDIA3，发现其尾静脉出血时间延长，血小板聚集欠佳，αIIbβ和P选择素的表达受到抑制，可抑制血栓形成［22］。Wang等［23］发现PDIA3基因敲除小鼠的血小板数量和血小板糖蛋白表达没有变化，但尾静脉出血时间延长，颈动脉损伤后的血栓闭塞时间也延长。而采用肠系膜动脉血栓的模型，发现PDIA3基因敲除血小板聚集欠佳，激活整合素αIIbβ3能力欠缺，参与血栓形成的比例降低，导致血栓形成缓慢，于添加外源性的PDIA3后，血小板聚集缺陷能得到改善。

2.6肿瘤PDIA3调控STAT3信号转导与增殖，与癌症的发生密切相关。宫颈癌患者肿瘤组织与宫颈上皮内瘤变组织或正常组织相比，PDIA3的mRNA和蛋白表达均降低，而PDIA3的表达高低和总体生存率的高低呈正相关，提示PDIA3可能是宫颈癌预后的独立预测因子，改善PDIA3水平或可成为宫颈癌的治疗手段［24］。

上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)是一种酪氨酸激酶受体，能激活许多信号级联反应，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生。Gaucci等［25］发现敲除乳腺癌细胞的PDIA3基因后，该细胞的EGFR表达、在细胞膜上的分布以及与EGF的结合都未发生改变，但是其磷酸化和内在化受到影响，提示PDIA3可通过影响EGFR的活化间接调控肿瘤的发生。

在哈萨克族食管鳞状细胞癌患者中，PDIA3的表达较正常人群下降52%，且下降的程度与肿瘤分级、淋巴结转移和侵犯深度相关［26］。同时，PDIA3还与胆囊癌患者的肿瘤进展与临床表现有关，是潜在的诊断与判断预后的生物标记［27］。另外，有研究表明PDIA3能调节人类结肠癌细胞化疗的敏感性，有望成为新的化疗分子靶点［28］。

2.7神经退行性病变阿尔茨海默氏症的发病归因于β-淀粉肽的沉积导致的神经毒性。正常情况下，脑脊液中的β-淀粉肽与PDIA3和钙网蛋白作为复合物存在，受内质网的翻译后加工系统催化，而内质网的催化及加工能力随着年龄的增长而减弱，使得β-淀粉肽不能形成复合物而发生聚集，从而导致相应疾病的发生。

5-S-半胱氨酰多巴胺(5-S-cysteinyldopamine，CysDA)参与帕金森神经退行性病变，主要是由于其能诱导大量的氧化应激和蛋白聚集有关，而其中最重要的是PDIA3表达上调，这在帕金森模型小鼠和细胞中得到了印证［29］。

2.8生殖在人类精子发生过程中，PDIA3存在于精母细胞、精子和人睾丸的Leydig细胞胞质中，在Sertoli细胞中也有少量表达，而精子顶体内的PDIA3则是精卵融合所需的［30］。国内学者在大鼠的精母细胞和精子［31］中也发现有PDIA3的分布，同样表明其在精卵融合过程中发挥重要作用。另外，PDIA3或许能成为男性不育的一个新的表型标记，并可以用于体外受精精子的选择。

3研究展望

如上所述，PDIA3与众多疾病的发生发展息息相关，是一种有效的干预中介，针对它的治疗成为当下临床应用新的突破点。近年来，关于PDI为治疗靶点的研究逐渐增多［32］，特别是抑制PDI活性的药物的研发，目前相应的药物主要有抗生素、巯基阻断剂、砷化合物、雌激素化合物及天然或人工合成的小分子化合物等，这些化合物大部分是通过不可逆性抑制PDI活性位点半胱氨酸来发挥作用，但药物数量有限，且缺乏选择性及有效性，并有显著的非靶向毒性，使得特异性抑制PDI活性成为目前药物研究的难点。而PDIA3作为PDI家族一员，已被证明能够被人工合成的丙炔酸氨基甲酰甲基酰胺16F16 (3)靶向抑制［33］，同时万古霉素能影响PDIA3与钙网蛋白间的相互作用，使构象发生变化，降低复合物的稳固性而发挥作用［34］。天然植物代谢产物Juniferdin［35］和槲皮素-3-芸香糖甙被证明对PDIA3无明显抑制作用［36］。另外，Trnková等［37］发现绿茶酚能轻度抑制PDIA3的还原酶活性，预防多种疾病的发生，起到保健作用。相关特异性抑制剂的研制和发展遭遇挑战的一个重要原因是PDI结构和功能的复杂性，有效抑制PDI的影响因素和机制未完全明了，而PDI抑制剂对PDIA3活性的影响则仍需进一步验证。

目前已能利用生物工程技术生产人类PDIA3蛋白。酵母细胞是生产人类PDIA3蛋白的优良宿主，能识别和加工人类PDIA3蛋白的天然信号肽，分泌重组PDIA3蛋白，该蛋白拥有天然蛋白的氨基酸序列和生物活性，经过纯化后能达到10 mg/L，能为进一步研究内质网外的PDIA3生物学功能及进行生物学治疗提供便利［38］。

4结语

现有研究表明PDIA3与多种疾病发生发展密切相关，检测或干预相关部位的PDIA3表达水平，可能成为疾病早期诊断与治疗的新靶点。目前，关于PDIA3的认识尚未完全明了，还有待进一步研究，如对PDIA3生物学功能深入探讨则可促进对相关疾病机制的认识，而研究各个相关疾病中PDIA3的变化将有助于对其有一个更全面的认识。PDIA3是疾病发生发展的反应性变化，亦或是导致疾病发生发展的主导原因仍值得深入发掘，同时，基因干预将成为主要手段，以深化PDIA3治疗作用的研究。

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·实验技术·

通讯作者△Tel: 0571-87032028; E-mail: lvbin@ medmail.com.cn

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81170348) ;浙江省自然科学基金资助项目(No.LZ12H03001) ;高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(No.722212A001)

［收稿日期］2015-02-15

［文章编号］1000-4718(2015)06-1145-05

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.032