大鼠胸髓横断后腰髓下运动神经元的变化

熊国星，洪毅，张军卫，陈世铮，关骅

·基础研究·

大鼠胸髓横断后腰髓下运动神经元的变化

熊国星1，洪毅2，3，张军卫2，3，陈世铮2，3，关骅2，3

目的 探讨脊髓损伤后远端下运动神经元结构、功能的改变。方法 将70只Sprague-Dawley大鼠随机分为T10脊髓横断3 d组（n=10）、1周组（n=10）、2周组（n=10）、4周组（n=15）、8周组（n=15）和假手术组（n=10），进行L4-6脊髓节段TUNEL荧光标记、AChE酶组化定量检测。结果 TUNEL标记法观察损伤远端脊髓前角的细胞凋亡情况，结果仅偶见荧光标记物。脊髓横断3 d时，AChE阳性运动神经元（面积＞300 μm2）的OD值明显减小（P＜0.01）；损伤1周时，OD值突然明显增大（P＜0.01）；随后OD值再次下降，至4周时降至最低点，然后再次增加，8周时与假手术组仍存在显著性差异（P＜0.05）。结论 脊髓损伤后远端下运动神经元没有明显减少及结构的不可逆改变，但代谢功能发生显著的可逆性变化。

脊髓损伤；跨神经元变性；功能重组

［本文著录格式］熊国星，洪毅，张军卫，等.大鼠胸髓横断后腰髓下运动神经元的变化［J］.中国康复理论与实践，2015，21（2）: 142-147.

CITED AS:Xiong GX，Hong Y，Zhang JW，et al.Functional and structural changes of lower motor neuron distal to the site of rats with spinal cord transection at T10［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2015，21（2）:142-147.

脊髓损伤后有无跨神经元变性，目前尚无定论［1］。早期组织形态学研究结果显示，脊髓损伤后远端神经元数目明显减少（20%甚至更多），支持跨神经元变性的存在［2］。而近年来运用神经元示踪方法，研究发现脊髓损伤后远端下运动神经元数目无明显减少，不支持跨神经元变性的存在［3］；有的研究发现数目减少但认为是其他的原因影响数目的减少［4］。

脊髓损伤后其远端神经元结构和/或功能的改变将会影响神经再生及功能重建的过程和结果。通过对脊髓损伤远端下运动神经元结构和功能变化的研究，将对脊髓损伤功能重建研究提供科学依据，也将对脊髓损伤功能康复（如功能性电刺激）疗效评估提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Sprague-Dawley雌性大鼠70只，体重为200～250 g，均购自中国军事医学科学院动物饲养中心。随机分为脊髓横断3 d组、1周组、2周组各10只，4周组、8周组各15只，假手术组（椎板切除组）10只。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备

消毒器械一套，以体积分数为10%的水合氯醛腹

2 结果

2.1 L4-6前角细胞TUNEL荧光标记结果

假手术组偶见散在的荧光标记物，主要出现于白质区域。

脊髓横断组3 d、1周、2周、4周、8周组损伤远端脊髓前角偶见荧光标记物，其中1周组稍多。而损伤近端（1周组）灰质、白质区均见较多荧光标记物，阳性反应物表现出典型的核浓缩、核变形、碎裂现象。见图1。

2.2 L4-6前角细胞AChE酶组化检测及OD值

假手术组：光镜下见AChE阳性部位分布和密度与Nacimiento报道［5］的一致。主要分布于脊髓前角，所有前角运动神经元内AChE活性较强，酶反应颗粒元没有直接受损。可见，损伤远端运动神经元所有的蛋白合成减少是AchE染色减弱最可能的原因。

脊髓损伤后运动神经元的AchE动态变化可能反映了AchE合成、轴索运输及不同分子形式转化的调节机制。损伤后超微结构研究可能有助于判断是否有AchE的运动神经元细胞内再分布。

3.2 脊髓损伤远端下运动神经元未见明显凋亡

凋亡一词由Kerr等于1972年首次提出。它是以细胞和细胞核皱缩、染色质密度增加，膜芽出为特征，因其过程需要精确的基因转录和一定量蛋白质合成，因此被认为是一种主动性、不同于坏死的死亡形式。1996年Li等首先观察脊髓压迫损伤后的细胞凋亡现象，发现在伤后的第4天和第9天分别出现较多的凋亡细胞，主要是少突神经胶质细胞，都分布在白质的前索、侧索和后索中，持续3周以上，而灰质内未见有细胞凋亡［8］。Crowe等通过改良Allen氏法致伤猴脊髓T10节段，运用TUNEL法进行观察，结果发现伤后6 h在损伤部位出现神经细胞凋亡，伤后8 d和3周凋亡细胞主要分布在损伤部位两端脊髓的传导束内，并可见到髓磷脂，提示凋亡可能同时伴有脊髓传导束的Wallerian变性［9］。而Yong等在大鼠脊髓严重挫伤模型中发现白质、灰质均在伤后1 d发现凋亡表现［10］。但目前凋亡机制不很清楚，可能是源于导致轴突脱髓鞘的不利细胞环境，或者是Wallerian变性的结果，也可能二者皆而有之。

用于检测细胞凋亡的方法较多，其中TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法。该方法是对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能较准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片等，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用［11］。本研究中，使用TUNEL法观察大鼠脊髓横断的远、近端神经细胞凋亡情况。发现损伤近端凋亡现象明显，而远端很少见到凋亡细胞，而且凋亡细胞主要在白质区，这些与以前的研究所见相一致。表明脊髓损伤后远端运动神经元无明显的继发凋亡。

3.3 脊髓损伤远端下运动神经元可能有可逆性变性

神经系统损伤后存在跨神经元变性。如初级视皮层被摘除3年后，26只恒河猴视网膜节细胞明显减少，考虑为跨神经元变性［12］，侧枕叶梗死后可见双侧视神经萎缩［13］，多发性侧索硬化儿童丘脑、胼胝体压部明显缩小［14］。不过，脊髓损伤后是否有跨神经元变性存在争议。

20世纪90年代以前，大多数研究证实脊髓损伤后其远端及大脑皮层存在跨神经元变性。Van Alphen等报道截瘫患者（颈髓、胸髓损伤3例）死亡后发现腰骶髓前角细胞减少。Eidelberg等报道成年大鼠T8～T10脊髓完全横断后1周光镜和电镜下L4～L5运动神经元有明显减少（约25%）［2］。上述作者结论均认为存在跨神经元变性。

国内学者观察了大鼠T12脊髓横断后头尾两端的局部改变，光镜下见C4、L4前角神经元有破碎、消失或固缩，腰髓前角的变化是跨神经元变性，电镜下观察分为暗变性、亮变性和坏死崩解。Bose等进行大鼠胸髓（T8）挫伤4个月后的研究，非结合型霍乱毒素B亚组溶液注射入比目鱼肌行逆行性神经元标记。神经元标记结果发现，胸髓损伤大鼠比目鱼肌运动神经元减少16%，且神经元大小分布和树突形态发生明显变化。认为数目和形态的变化可能源于细胞减少（跨神经元变性），或中等细胞向大细胞转变，或中等细胞不能运输免疫标记物［3］。

但是，20世纪90年代以来，很多研究对脊髓损伤后跨神经元变性的存在提出疑问。McBride报道，完全横断成年雌性大鼠T9，荧光金逆行性标记脊髓横断组和假手术组右坐骨神经运动神经元。结果发现，脊髓横断组和假手术组在术后10、20、52周标记的运动神经元数目或分布没有区别。认为脊髓损伤后没有发生跨神经元变性［15］。Bjugn等报道光学体视框技术（optical disector）观察胸髓横断的小白鼠腰髓前角神经元的变化。结果表明没有腰段前角神经元减少。不过，腰段前角的平均大小脊髓横断组（2.49 mm）较假手术组（3.05 mm）减小（P＜0.05）。结论仍认为脊髓损伤后没有发生跨神经元变性［3］。

跨神经元变性常发生在原发损伤几周后，故Bjugn［3］认为Eidelberg报道的脊髓横断24 h内见到的跨神经元变性可能有其他的原因。

Van De Meent报道345例颈髓损伤患者的小指展肌、拇外展肌最大复合动作电位明显减小，半年后有不同程度恢复［1］，与本研究中胆碱能神经元代谢功能的动态变化曲线相似，提示脊髓损伤后其远端可能发生可逆的跨神经元变性。

综上所述，脊髓损伤后跨神经元变性存在与否，之前的研究集中在神经元数目是否减少上。不可忽略的是，跨神经元变性可能主要是形态学的改变尤其是突触形态学的改变，神经元数目的减少可能并不明显。之前不一致的研究结果，可能与研究的方法学不同有关，这其中包括计数方法和示踪剂等不同。

脊髓损伤后远端下运动神经元可逆性变化的研究为损伤后若干年脊髓功能重组、脊髓移植提供了理论上成功的可能。

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［14］Aubert-Broche B，Fonov V，Ghassemi R，et al.Regional brain atrophy in children with multiple sclerosis［J］.Neuroimage，2011，58（2）:409-415.

［15］McBride RL，Feringa ER.Ventral horn motoneurons 10，20 and 52 weeks after T-9 spinal cord transection［J］.Brain Res Bull，1992，28（1）:57-60.

中国残疾人康复协会康复技术专业委员会2015年国家级继续医学教育项目安排

一、第48届物理疗法与作业疗法技术培训班，项目编号2015-16-00-096（国）；2015年4月13～24日；北京，中国康复研究中心；学费1600元，资料费220元，住宿费自理。

二、第9届全国认知障碍诊断与康复治疗技术学习班，项目编号2015-16-00-095（国）；2015年8月10～14日；北京，中国康复研究中心；学费1200元，资料费150元，住宿费自理。

三、第8届全国康复评定技术研讨班，项目编号2015-16-00-097（国）；2015年8月17～21日；北京，中国康复研究中心；学费1200元，资料费150元，住宿费自理。

各班名额有限，欢迎积极报名和邮件、电话咨询。

联系人：李炜垣老师。联系电话：（010）87569503，87569502或手机短信：13810520552；E-mail:xxbbm2011@163.com；地址：北京2619信箱，中国康复研究中心康复评定科，邮编：100068。

Functional and Structural Changes of Lower Motor Neuron Distal to the Site of Rats with Spinal Cord Transection at T10

XIONG Guo-xing，HONG Yi，ZHANG Jun-wei，CHEN Shi-zheng，GUAN Hua.Department of Rehabilitation，School of Public Health，Capital Medical University，Beijing 100069，China

Objective To investigate the structural and functional changes of lower motor neuron distal to the site of spinal cord injury in rats.Methods Seventies Sprague-Dawley rats were divided randomly into 6 groups:sham-operation group（controls，n=10）and 3 day group（n=10），1 week group（n=10），2 week group（n=10），4 week group（n=15）and 8 week group（n=15）after spinal cord transaction at T10. Neuronal apoptosis and acetylcholinesterase（AChE）activity of spinal cord at L4-6were observed by using the terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）method and the semiquantitative enzyme cytochemistry，respectively.Results The assessment of apoptosis by TUNEL labeling showed that fluorescent markers were observed occasionally in anterior horn distal to the site of injury.The optical density（OD）value of AchE positive motor neurons（area＞300 μm2）initially decreased about 3 days after transaction and then overshot 1 week or so.However，after that，the OD value decreased again，the lowest about 4 weeks.Then the OD value increased again，though at 8 weeks was still lower than that of controls（P＜0.05）.Conclusion The findings on indistinctive apoptosis provided the proof of no significant changes of lower motor neuron distal to the site of transection.Semiquantitative histochemical results about AChE reflected marked metabolic changes of motoneurons caudal to the transaction，which represented as part of functional reorganization.

spinal cord injury；transneuronal degeneration；functional reorganization

R651.2

A

1006-9771（2015）02-0142-06

1.首都医科大学公共卫生学院康复医学教研室，北京市100069；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068；3.中国康复研究中心北京博爱医院脊柱脊髓外科，北京市100068。作者简介：熊国星（1973-），男，汉族，湖北云梦县人，康复医学博士，副教授，主要研究方向：神经康复、骨科康复。腔注射麻醉（300 mg/kg）。俯卧位四肢外展固定于手术台，常规术区备皮、消毒，铺无菌孔巾。

以T9-11为标志确定T8椎板棘突，沿棘突做纵行切口约4 cm，切开皮肤及浅筋膜，并皮下游离。尖刀片紧贴棘突骨面两侧（以减少因切开肌肉所致肌间出血）做椎旁肌纵行切开，显微撑开器撑开两侧椎旁肌，暴露术野，咬除T7-9棘突，显露椎板，蚊式止血钳横向轻轻钳夹摩擦椎板直至显露硬膜囊外间隙。由尾侧向头侧咬除椎板直至两侧椎弓根，完整暴露脊髓。参考Basso方法，眼科手术刀于T10节段处连同硬脊膜和脊髓一同快速切断，可见大鼠后肢痉挛性抽搐数次后软瘫，切除2 mm宽脊髓组织，并以弯头显微镊轻抬起脊髓两断端，直视下两人证实脊髓完全横断。创口敷洒庆大霉素。逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤，术毕。

假手术组仅剥离椎板，不伤及脊髓，其他处理均同脊髓横断组。

1.2.2 术后一般护理

饲养环境的温度控制在20～25℃，定期通风；勤换饲养笼垫料，保持干燥，因尿失禁而被浸湿的肢体及时用温水清洗擦干。术后常规每日庆大霉素（2～4）× 104U/kg皮下或肌注，直到血尿、脓尿停止，尿液澄清，此期大约1周左右。

如停药后再次出现泌尿系感染征象，则立即恢复抗生素治疗，直至症状消失。每天按摩、挤压膀胱协助排尿2～3次，促进大鼠反射性膀胱形成，恢复排尿反射，恢复排尿反射时间约2～4周。

同时每日两次轻揉大鼠腹部及双后肢，预防肠梗阻和压疮的发生。吹风机干燥皮毛以减少压疮的发生。

术后大鼠分笼饲养以减少相互撕咬及自噬。

1.2.3 取材、切片制备

脊髓横断组大鼠分别于术后3 d、1周、2周、4周和8周水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg），自左心室插管后剪开右心耳，快速灌注生理盐水冲洗，待流出的液体清亮后，用4%多聚甲醛经心内灌注，取出脊髓损伤节段及尾侧5 mm外节段（L4-6），在4%多聚甲醛中固定12 h，入30%蔗糖磷酸盐缓冲液至组织块下沉为止。损伤位点节段制作30 μm厚冰冻连续纵切片以备确认完全横断模型成功，损伤尾侧节段分别制作10 μm、30 μm冰冻连续横断切片，行酶组化、免疫组织化学染色。

假手术组于术后7 d取材，其操作与脊髓横断组一致。

1.2.4 TUNEL法对L4-6脊髓凋亡细胞行荧光标记

取脊髓横断组、假手术组距断端尾侧5 mm处以及1周组横断尾侧邻近损伤处10 μm厚冰冻横断切片，按TUNEL标记法对凋亡细胞进行标记。

冰冻切片浸洗后浸入封闭液（3%H2O2）中，室温15～25℃封闭10 min；漂洗后浸入通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠）中，冰上（2～8℃）促渗2 min；漂洗后每个样本滴加50 μl TdT酶反应液（Equilibration Buffer 45 μl+FITC-12-dUTP 1 μl+TdT Enzyme 4 μl，阴性对照片不加TdT酶），加盖玻片37℃避光湿润反应60 min；漂洗后LEICA DC100荧光显微镜下（激发波长450～500 nm，发射波长515～565 nm（绿））观察细胞凋亡情况。

1.2.5 L4-6脊髓AChE酶组化染色定量检测

脊髓横断组和假手术组每组取6只大鼠，距断端尾侧5 mm处脊髓组织的30 μm厚冰冻横断切片，入碘化硫代乙酰胆碱配制的孵育液室温24 h，按Mesulam氏法漂洗后铁氰化钾染色显示乙酰胆碱酯酶（AchE）。观察各组酶染色差异。

每只大鼠随机选取3个脊髓标本，6个前角，每组各36个前角映像，应用LEICA Q500IW型自动彩色图像分析仪进行运动神经元胞体光密度（optical density，OD）值定量分析。以OD值表示酶活性。OD值越大其酶活性越高。

1.3 统计学分析

2014-04-16

2014-05-21）

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.02.005