脑缺血灌注损伤的相关细胞通路调节研究进展

樊鸿浩, 李茹冰

(广州军区广州总医院药剂科, 广东 广州 510010)

脑缺血灌注损伤的相关细胞通路调节研究进展

樊鸿浩, 李茹冰

(广州军区广州总医院药剂科, 广东 广州 510010)

脑缺血灌注损伤主要指缺血脑组织恢复血液灌注后，脑组织损伤加重的病理现象。涉及缺血再灌注损伤后的相关细胞分子通路十分广泛，如NF-κB通路、酸敏感离子通路、超极化激活环核苷酸门控阳离子通路、丝裂原激活蛋白激酶通路、基质金属蛋白酶通路和水通道蛋白通路等，其主要参与再灌注损伤机制包括基于炎症、凋亡相关通路调节机制；基于钙离子作用相关通路调节机制；基于细胞凋亡通路调节机制以及脑水肿变化的通路机制。本文拟总结主要参与脑缺血再灌注损伤后的细胞分子通路及其作用机制，为进一步了解再灌注损伤机制提供参考。

脑缺血再灌注; 酸敏感阳离子通道; 基质金属蛋白酶; 丝裂原激活蛋白激酶; 水通道

脑缺血灌注主要为缺血脑组织恢复血液灌注后，脑组织损伤反而加重，电镜观察表现为脑微血管内皮细胞固缩，内皮细胞连接间隙和通透性增加，部分可见连接内皮细胞的基质和基膜缺失、胶质细胞伪足肿胀、进行性退变和微血管腔狭窄等[1]。目前研究已经证实，导致脑缺血再灌注后损伤作用的直接原因主要有自由基生成增多、钙离子超载、兴奋氨基酸过度释放、蛋白酶通路激活和内皮细胞黏附因子表达等。目前临床仍无有效的治疗缺血性脑损伤方法，主要因于缺血再灌注损伤涉及细胞通路及作用机制十分广泛并互相交叉，而单一的药物干预治疗无法有效减轻脑缺血再灌注损伤[2]。因此，本文回顾总结国内外缺血再灌注后细胞分子通路的变化，深入了解脑再灌注损伤后分子作用机制，为开发新的药物靶点提供参考。

1 基于炎症和凋亡相关的NF-κB通路调节

研究已经表明，核转录因子NF-κB参与了脑缺血再灌注后的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)破坏，NF-κB具有多向性调节作用，从成熟B淋巴细胞的核抽提物中检测到的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子上一段10 bp的核苷酸序列(GGGACCTTTCC)特异结合的核蛋白[3]。NF-κB隶属Rel蛋白家族，包括 p50(NF-κBl), p65(Rel-A), RelB, C-Rel和p52 (NF-κB2)，其以同源或异源二聚体形式组成NF-κB，以p50/p65异源二聚体最为常见，也以RelA(p65)最为深入研究。在正常非激活状态下，RelA(p65)与IκB蛋白结合，不表现转录功能，并滞留在胞浆中。当中枢神经系统发生某些病理改变时，IκB的上游激酶(IκB-kinase，IKK)磷酸化而被特异性激活。IKK使IκB降解，由于p50有核定位信号，缺少IκB的束缚，p50/p65将往细胞内传递。RelA(p65)可识别特定的DNA序列，并与之结合，从而调控靶基因的转录。NF-κB分布在内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、脑室壁和血管壁平滑肌上，其表达情况与脑缺血再灌注高度相关，普遍认为脑缺血再灌注6 h后，BBB上NF-κB激活达高峰，并呈动态调节过程[4]。脑缺血再灌注后，脑内皮细胞产生大量自由基，攻击生物膜，诱发内皮细胞NF-κB表达，NF-κB通路激活传递细胞核内相应炎症靶基因转录，同时基膜的损害也加剧BBB的完整性缺失。研究表明，NF-κB表达是一种快速的适应性反应，与胞浆内对NF-κB 的活化有抑制作用的蛋白IκB，包括IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBδ, IκBε和Bcl-3等相互调节[5]。因此，缺血再灌注发生后，合理调整NF-κB与IκBα结合的平衡，对维持BBB正常功能、保护脑神经细胞具有重要的临床意义。NF-κB通路广泛涉及缺血再灌注后机体损伤机制。动物实验显示，某些中药成分，如皂苷类、黄酮类、有机酸、酚类、生物碱和萜类等中药活性成分都发现在脑缺血再灌注的大鼠模型中显示一定的保护作用[6]，这些活性成分多数具有抗氧化和抗炎症的自身特质。Zhang 等[7]发现，厚朴酚能减少炎症因子生成，如一氧化氮、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和大鼠正常T细胞表达和分泌因子，可减轻大鼠缺血再灌注模型中脑损伤，保护脑神经细胞，其保护机制可能通过抑制神经胶质细胞NF-κB通路活性。体内外实验也显示，厚朴酚具有良好的抗炎作用。炎症反应贯穿整个缺血再灌注发生过程，抗炎因子通路有望成为再灌注损伤保护的靶点。Cui等[8]报道，丙泊酚(异丙酚, propofol)通过NF-κB/P53信号途径能减轻缺血再灌注后的神经损伤，下调P53蛋白水平表达，同时抑制自噬相关基因和微管相关蛋白1轻链表达，显示NF-κB通路激活与自体吞噬和凋亡相关作用。可见，NF-κB通路的激活与缺血再灌注后的炎症发生、自噬凋亡、氧化反应和自由基攻击互相联系，与脑再灌注损伤密切相关。然而缺血再灌注发生后，BBB通透性虽有所改变，药物静脉注射后是否能有效穿透颅内却仍然有待探索。Feng 等[9]使用电针刺激治疗缺血再灌注大鼠模型中显示良好的预后结果，电针刺激百会穴和神庭穴能下调凋亡相关基因Bax和Fas表达，抑制神经细胞凋亡，减少脑梗死面积，通过刺激此两穴能抑制大鼠脑细胞NF-κB通路激活。电针刺激穴位法有望在临床上应用。

2 基于Ca2+相关的酸敏感离子通道及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道调节

关于酸敏感离子通道(acid sensing ion channels, ASIC)在脑缺血再灌注作用机制的研究相对较早。ASIC广泛分布于哺乳动物的外周和中枢神经系统中，有4个功能基因编码，分别为ASIC1，ASIC2，ASIC3和ASIC4。ASIC作为酸性的传感器通道，在正常脑组织氧化代谢产物更新转换和维持正常细胞功能微环境上具有重要的作用[10]。正常状态下细胞内外pH维持需要ASIC通道输运氢离子调节，脑缺血再灌注后，组织炎症，BBB完整性破损等病理过程都能诱发细胞和组织代谢功能障碍，以厌氧性葡萄糖代谢为主的代谢性酸积累，导致细胞内pH值明显下降[11]，缺血重度损伤时，pH值降至7.10±0.04，pH变化大小与缺血后灌注处理，如时间间隔和灌注血量明显相关[12]。细胞内氢离子增多能损伤神经细胞，以ASIC受体诱发的细胞钙离子超载最为严重，钙离子通道与ASIC相互关联，在脑缺血再灌注研究中，越来越受到重视。更有人认为，神经细胞内钙离子超载才是脑缺血再灌注后神经组织不可逆损伤的关键因素[13]。早期研究就已经证实，局部缺血后引起组织酸化，ASIC通道被激活并转运钙离子进入细胞内[14]，钙离子流向胞内过程可能由钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)介导。程慧娴等[15]建立大鼠全脑缺血再灌注模型后，利用ASIC阻断剂狼蛛毒素阻断ASIC转运氢离子，发现ASIC阻断剂能减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤，同时提示其抗损伤作用与CaMKⅡ表达下调有关，这意味着ASIC阻断剂极可能通过减低胞内钙离子浓度来减轻神经细胞损伤。CaMKⅡ是Ca2+的一个重要靶酶，CaMKⅡ在脑组织含量非常丰富，尤其在海马区中，调节机体记忆和神经活动[16]。病理条件下，细胞内Ca2+超载可激活CaMKⅡ产生磷酸化，引起磷酸化的CaMKⅡ增多累积，这种级联反应可破坏细胞离子平衡，由于Ca2+内流增加生成更多的自由基, 诱发更多溶酶体溶解和酶的释放, 并加重磷酸盐和蛋白酶对膜的破坏, 最终损伤神经细胞和组织[17]。近年来，脑缺血再灌注后引起细胞超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated channel，HCN)变化也备受关注。HCN主要影响动作电位发放的频率重要通道之一，包括HCN1，HCN2，HCN3和HCN4 4种亚型，HCN在学习记忆功能，炎症痛，窦房结缺血再灌注保护都发挥着重要作用[18-19]。在神经元及心肌细胞中，由电压依赖性的钙离子内流作为诱导动作电位产生起点，参与其神经递质释放和心肌收缩的过程，而HCN通道早期已经被证实能通过激活神经元的起搏离子通道易化动作电位引起细胞分泌[20]。文献报道，应激条件下HCN通道可增强大脑神经元钙离子内流，改变其可塑性及兴奋性递质释放，引起兴奋性损伤，这可能是癫痫发作发生的原因之一[21-22]。黄维等[ 23]应用膜片钳技术和荧光测钙技术证实，大鼠大脑内存在钙离子依赖性的神经递质分泌，并通过腺嘌呤核苷酸受体调控的HCN通道，有可能参与机体感觉信息传递。He等[24]利用低剂量HCN通道阻断剂4-(N-乙基-N-苯氨基)-1,2-二甲基-6-(甲氨基)嘧啶氯化物，即ZD7288处理氧糖剥夺的海马细胞，抑制动作电位依赖性的长时效增强(long-term potentiation，LTP)，该过程可抑制由LTP相关的兴奋递质释放激活系统，减轻其兴奋性毒性, 并减少突触后致密物质-95表达。实验结果表明， ZD7288可改善海马神经元突触塑型，保护海马神经。然而，尽管目前仍没有直接证据表明脑缺血再灌注后HCN通过增加钙离子内流，诱发神经元兴奋毒性，参与缺血再灌注损伤的分子机制。但前期实验已表明，HCN通道参与缺血再灌注损伤的兴奋性调节过程，而钙离子作为脑神经元兴奋的信使之一，很有可能通过诱导兴奋性递质释放或钙离子超载参与HCN通道调控机制。杜雅莹等[25]观察发现，假手术组HCN1 mRNA表达百分率为0.95±0.13，而单纯缺血组为0.21±0.03，缺血再灌注2 h组为0.43±0.02，缺血再灌注6 h为0.27±0.07，缺血再灌注24 h为0.59±0.09，提示HCN可能参与脑缺血再灌注后保护作用进程，缺血再灌注6 h后表达最低，与前文所述的脑缺血再灌注6 h后BBB上NF-κB激活高峰时间相一致，亦是脑缺血再灌注的最为严重的时间点，HCN表达与缺血再灌注保护强度的相关性需要进一步研究。

3 基于细胞凋亡通路的丝裂原激活蛋白激酶通路

丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)存在整个中枢神经系统中，MAPK参与调节细胞生长和发育等过程，可被各种细胞因子、神经递质因子和应激反应等条件激活。在真核生物中，MAPK信号通路包括细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路、P38通路和ERK5通路。这些通路都与缺血再灌注损伤密切相关，以MAPK激酶(MEK)/ERK通路研究最多。MEK1/2是MAPK的一员，分子质量依次为44和45 ku，而ERK1/2为MEK1/2下游蛋白，分子质量依次为44和42 ku。MEK/ERK通路调节细胞生长和分化过程，当Raf被激活后，能与MEK1/2结合，激活MEK1/2催化区第217位和221位丝氨酸磷酸化，并激活ERK，被激活的 ERK进入细胞核后，启动一些即早基因的表达如c-jun和c-fos等，表达的c-jun和c-fos蛋白以异二聚体或c-jun同二聚体(即 AP-1转录因子)形式结合到AP-1启动子结合位点，诱导细胞周期蛋白D、 细胞周期蛋白E、 细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2， CDK2)和CDK4等基因转录与翻译，促进细胞从G1期进入 S期。活化的ERK 能够磷酸化并灭活P27和P21等细胞周期抑制蛋白，刺激细胞的增殖；活化的ERK 能够抑制胱天蛋白酶的激活，并可以诱导一些抗凋亡因子的表达，如内质网跨膜蛋白需肌醇酶1和凋亡蛋白抑制因子，而胱天蛋白酶的激活可以裂解维持细胞生存的蛋白，从而导致细胞死亡。研究表明，MAPK通路参与脑缺血再灌注后脑神经细胞凋亡途径，当脑缺血发生时，脑组织中的神经元细胞处于缺血缺氧的条件时，神经元细胞会发生自噬和凋亡。Zhan等[26]通过延迟缺氧后处理在成年大鼠中可减少缺血后神经细胞损伤，其神经细胞保护作用与激活Akt/FoxO通路和抑制MEK/ERK通路激活相关。Wang等[27]也发现，MEK/ERK通路的抑制可减少缺血区中促炎因子白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)表达，对保护局灶性缺血发挥重要作用，保护机制可能通过抑制下游Elk-1磷酸化，进一步减少IL-1β的mRNA生成，但不通过下调TNF-α、IL-1α或趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-α表达。可见MEK/ERK通路激活后级联的下游因素非常广泛，并涉及到凋亡途径，炎症反应过程。事实上，MEK/ERK通路并非孤立，它与其他的转导途径相互交叉联系，如 PI3K/AKT 通路、JNK通路、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinases-3β， GSK3β)通路和胱天蛋白酶3等。JNK通路是其中一支重要的促凋亡通路，与缺血再灌注损伤有着密切联系。JNK信号通路介导的细胞凋亡机制可活化c-Jun/AP1，上调促凋亡蛋白表达，如Bcl-2家族蛋白；活化p53和p73，引起p53/73依赖性凋亡。Wu 等[28]在心肌缺血再灌注模型中发现， JNK抑制剂SP600125预处理后的心肌再灌注模型，明显增强离体心脏收缩力，减少缺血面积和乳酸脱氢酶活性，同时减少凋亡率，而ERK1/2抑制剂PD98059单独使用却效果不佳；更有趣的是，PD98059处理后能增加JNK表达，SP600125能激活心肌再灌注模型的ERK1/2通路，显示心肌再灌注模型中 JNK通路可能处于ERK1/2通路上游位置，并共同调节细胞凋亡方向。由此可见，细胞凋亡涉及的转导途径互相交叉影响，单一的细胞分子信号通路阻断治疗，并无法有效治疗再灌注损伤。中药成分多具有抗氧化、抗炎症或抗凋亡作用，这为寻找有效治疗缺血性脑损伤药物提供一定参考思路。黄芩苷、紫草素、小檗碱(黄连素)和川穹等中药成分都被表明具有抗凋亡或抗氧化作用，如利用碘化丙啶显示缺血区的细胞死亡情况，证实小檗碱能减少细胞死亡数量，提高神经细胞存活率；Western蛋白印迹分析结果表明，Akt的蛋白质、GSK3β、ERK和JNK蛋白都参与其神经保护过程，而小檗碱20 μmol·L-1能有效抑制胱天蛋白酶3活化，具有良好的神经保护作用[29]。然而中药有效成分十分复杂，难以明确药物作用具体靶点，同时药效成分是否能较好通过血脑屏障，这些都是阻碍中药成分应用于临床的原因之一。因此，药物开发应更多注重中药有效成分提取工艺的优化及药物分子结构的简化。

4 基于脑水肿变化的蛋白金属酶通路和水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一组锌依赖性蛋白水解酶，具有降解多种细胞外基质成分的功能， 具有不同程度的特异性。再灌注损伤发生后，最初的表现往往为脑水肿，其中与之密切相关的通路是MMP-9/MMP-2通路和AQP5水通路。 脑缺血及再灌后已经表明，MMP的表达明显增高，尤其是MMP-2和MMP-9活性增加，这与脑微血管通透性、BBB通透性、BBB的崩溃、炎性细胞侵入和脑水肿明显相关。MMP-2和MMP-9作为明胶酶类最为显著的特征，能够激活多种促炎因子如IL-8、IL-1β和TNF-α产生。此外， MMP-9更参与基膜主要成分-Ⅳ型胶原蛋白的消化和紧密连接蛋白消化，可促进白细胞跨内皮或血浆蛋白透过，破环颅内渗透性平衡，进一步促进脑水肿[30]。Smimbo等[31]认为，再灌注引起的损伤是由中性粒细胞高度表达MMP-9和髓过氧化酶，生成大量活性氧破环细胞膜，引起脑水肿；使用脂质体血红蛋白动脉灌注疗法可减轻缺血区大鼠的神经损伤，其保护机制可能由于血红蛋白灌注能减缓缺血区内渗透平衡，而血红蛋白参与了活性氧的消除过程。也有学者使用褪黑素注射缺血模型组大鼠发现，褪黑素能够减少MMP-9表达，抑制明胶酶活性，保护基膜完整性，维持颅内外渗透平衡，减少脑水肿，其保护效果与MMP-9基因敲除后大鼠效果并无统计学差异，提示MMP-9阻断剂有可能作为新型的药物靶点对早期脑水肿产生起有重要预防和治疗作用[32]。有人认为，MMP-9早期参与脑缺血再灌注后脑水肿的形成及再灌注损伤，而MMP-2可能主要参与后期组织修复及坏死组织清除[33]。Piao等[34]研究也表明，脑缺血后2 h MMP-9活性升高，损伤后6 h显著增强，48 h后达到高峰，而72 h后恢复到基线水平；相比之下MMP-2在6 h后才检测出活性上调，72 h后才达到高峰并持续7 d，提示MMP-2在脑损伤后6 h后才会参与BBB通透性调节，这结果和国内研究结果一致[35]。当然，也有学者通过MMP-2基因敲除大鼠在缺血1 h后再灌注模型中发现，Ⅳ型胶原蛋白和细胞闭合蛋白完整性相对野生型对照组好，水肿程度、出血量和梗死面积也大量减少，侧面说明MMP-2也参与了早期脑水肿的形成及再灌注损伤[36]。因此笔者认为，MMP-2和MMP-9都有可能参与早期脑损伤机制，其中MMP-9为早期主要参与者，而MMP-2主要参与后期继发性损伤和神经修复过程。脑水肿调节通路中还存在其他通路，研究较多的通路还有AQP水通道，AQP为疏水特性的小分子蛋白家族，其分子质量介于26～34 ku之间。迄今为止，人们在哺乳类动物已经发现13种AQP，并广泛分布在机体组织和细胞膜中，介导水分子进出细胞过程。AQP4是由4个独立的具有活性的亚单位组成异聚体结构，存在于脑星形胶质细胞，脑表面的软脑膜、 脑室系统的室管膜、 脉络丛、 下丘脑的视上核和室旁核等中，AQP4参与了脑再灌注损伤后初期减缓脑水肿形成，其可能机制是，再灌注后细胞间隙中K+、H+和谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度上升，激活蛋白激酶C对AQP4进行磷酸化反应，从而在一定程度上减少经由破坏的血脑屏障进入脑组织细胞间隙, 以及经胶质细胞膜进入细胞内的水分子的量，进而减缓脑水肿[37]。抑制AQP4 表达或功能的药物能限制人类细胞毒性脑水肿，但是 AQP4 基因敲除会使血管源性脑水肿加剧。在细胞毒性水肿中 ，AQP4 基因敲除会使水进入大脑的速率降低， 但是在血管源性水肿中 AQP4 敲除还会使水从大脑中转移出的速率下降。因此，AQP4在转基因小鼠中过度表达会加剧细胞毒性脑肿胀，然而AQP4 基因沉默可以诱导神经胶质瘤细胞的凋亡，抑制AQP4表达后胶质瘤细胞Bcl-2表达减少，可能为诱导瘤细胞凋亡的机制[38]。近年来， AQP8和AQP9发现广泛表达在肾、肝和脑组织线粒体内膜上，并显示可能通过释放细胞色素c来参与线粒体肿胀调节机制，线粒体肿胀进一步诱发凋亡刺激物产生。前期研究也显示，AQP4表达量与细胞色素c释放量呈负相关，提示AQP4的促凋亡作用还可能诱导细胞色素c释放引起线粒体肿胀，诱导凋亡刺激物产生[39]。

5 展望

参与脑缺血再灌注损伤的细胞通路或机制还有WNt通路、细胞黏附分子和内质网应激等，由于缺血再灌注损伤涉及体内分子通路或机制十分广泛并互相影响和级联，在早期研究中White等[2]已证实，单用胱天蛋白酶抑制剂可抑制细胞凋亡进程，却无法解释其抗脂质过氧化作用和快速修复细胞转录功能作用，相反，同样适用于抗氧化物质的抗氧化作用和抑制凋亡进程关系。他们表示单一的药物干预无法进行有效的治疗，并提出联合治疗设想：包括恢复细胞转录功能、抑制凋亡进程、减少自由基产生和抑制蛋白降解的联合治疗方案。如按广泛性的细胞通路或机制看联合方案十分明确和合理，然而在缺血再灌注后细胞分子信号通路变化并不是同时发生。Shaller等[40]认为，脑缺血阶段主要为氧化应激和炎症为主导的通路调节，而再灌注阶段为细胞转录抑制和细胞凋亡为主导的通路调节。因此，认识各阶段脑缺血再灌注损伤后BBB通透性的分子通路机制具有非常重要的意义。不仅如此，据前文所述，笔者认为中药药物开发及中医疗法，如电针刺激穴位法在对日后临床治疗和预后方面同样具有临床应用价值。

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(本文编辑: 乔 虹)

Cerebral ischemia-reperfusion injury and related cellular signalpathways: research advances

FAN Hong-hao, LI Ru-bing

(DepartmentofPharmacy,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Cerebral-ischemia reperfusion injury refers to cerebral tissue exacerbation injury after blood perfusion is restored in ischemic area. The related cellular pathways involved in ischemia reperfusion are varied, such as NF-κB signal pathway, acid sensing ion channels, hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide-gated, MAPKs signal pathway, Matrix metalloproteinases and AQP4. The main mechanism that participates in reperfusion injury involves the cellular pathway based on inflammation reaction and apoptosis, pathway based on calcium interaction, pathway based on cell apoptosis and the one based on brain edema. This article is intended to summarize the changes of cellular signal pathways and their mechanisms in ischemia reperfusion injury, thus shedding light on the injury mechanism after cerebral ischemia reperfusion.Key words: ischemia reperfusion; acid sensing ion channels; matrix metalloproteinases; mitogen-activated protein kinases; aquaporins

LI Ru-bing, E-mail: lrb90927@126.com, Tel: (020)88654670

广东省教育部产学研结合项目(2012B09- 1100170)

樊鸿浩(1989-), 男, 硕士研究生, 主要从事药理学及新药研究。

李茹冰, E-mail: lrb90927@126.com, Tel: (020)88654670

Foundation item: The project supported by Ministry of Education Combination Project of Industry and Research of Guangdong Province(2012B091100170)

2014-07-03 接受日期: 2014-11-22)

R972

A

1000-3002(2015)02-0310-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.020

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