心脏震波联合干细胞治疗在心血管领域的运用展望

王静、周超综述，郭涛审校

心脏震波联合干细胞治疗在心血管领域的运用展望

王静、周超*综述，郭涛审校

目前心血管疾病在全球疾病负担中居首位，仍须不断探索新而有效的治疗靶点和方法。干细胞在心血管疾病的应用就是一个既有进展又面临困难的新兴领域。 随着对干细胞作用机制的不断探索，旁分泌概念被提出，更加强调了在干细胞治疗过程中，核心机制是形成一个有利于干细胞归巢、激活、增殖、分化的心肌微环境。心肌基质细胞衍生因子（SDF）、CXC趋化因子受体4（CXCR4）、血管内皮生长因子（VEGF）等可能是这个微环境中的重要成分。另一方面已证实，心脏震波治疗具有促进血管生成等作用，而这些作用的机理正是基于心脏震波治疗上调了 SDF、CXCR4、VEGF 的表达。一些初期的实验研究也证实了心脏震波治疗可以促进干细胞在心脏的归巢和分化。因此心脏震波治疗同干细胞联合运用于心血管疾病将会是一个极具吸引力的研究方向。

心脏震波治疗；干细胞；旁分泌

尽管在心血管领域，近几十年有了长足的进展，但心血管疾病仍给社会、 经济造成了庞大的负担。据最新的全球疾病负担报告显示： 单在 2010 年，全球就有约1 290万人死于心脑血管疾病，换言之，每4个死亡的人中就有1个死于该病，居全球疾病负担的首位[1]。因此在全球范围内，研究者始终致力于寻找针对心血管疾病新而有效的治疗靶点及治疗方法。而心脏震波治疗和干细胞治疗都是基于此的探索，也都在基础研究和初期的临床试验中各自取得了不菲成就。在干细胞移植治疗中，形成一个有益于移植干细胞和原住心肌干细胞激活、归巢、增殖、分化的微环境是干细胞成败的关键之一；同时心脏震波治疗可以促进血管生成、抑制心室重构、改善左心室射血分数、抗炎、抗氧化等作用。这些作用的机制与干细胞微环境有着密切的关联。本文将对两种技术方法的内在联系做一综述， 以期将来心脏震波联合干细胞治疗能在心血管领域有更大的进展。

1 干细胞来源

心肌干细胞（Cardiac stem cell，CSC）：在上个世纪，经典理论认为哺乳动物心脏是终末分化器官，心肌细胞在出生以后便失去了自我更新能力，心肌细胞只能变长变大，而不能进行有丝分裂。然而这个理论如今已遭到颠覆[2]。运用14C 标记示踪法证实，心肌细胞的更新贯穿人的一生。25岁时，每年约有1%的心肌细胞进行了更新；而 75岁时，这个更新率只有0.45%[3]。现有证据表明，在出生以后，成人体内至少有四类细胞能增殖、分化为心肌细胞，为其提供更新：（1）驻扎于心脏干细胞巢内的心肌源性干细胞或心肌祖细胞[4]，此为狭义上的CSC。（2）骨髓源性的CSC或祖细胞[5]。（3）源于胚胎时期的心包脏层细胞[6]。（4）一些特殊成熟心肌细胞本身就可以再次进入细胞周期进行有丝分裂[7]。以上四类可认为是广义上的CSC。CSC在心脏再生方面是一个较有吸引力的研究方向，因为其从分化上讲，CSC 更接近于心脏，换言之更能线性分化为心肌细胞和血管细胞。在一些基础实验中，也证实CSC治疗可以修复和改善缺血的心肌功能[8,9]。但 CSC 研究难点之一在于本身数目较少，在心脏遭受如心肌梗死等打击时，难以完全替代、全部更新病变组织。故如何最大限度地激活和利用内源性的CSC是未来研究极具前途又亟待解决的一个堡垒。

心外干细胞：除此 CSC 以外，胚胎干细胞（ESC）、成肌细胞（myoblast）、诱导多能干细胞（iPSC）、骨髓干细胞[BMC,包括内皮祖细胞（EPC）、间充质干细胞（MSC）和造血干细胞（HSC）]等也能在人工诱导下定向分化为心肌细胞[10]。（1）ESC：自 1998 年首次分离得到人类ESC以来，不少研究已证实 ESC在体外诱导分化成为心肌细胞，使其能够代替受损的心肌细胞。而且由ESC分化而来的心肌细胞可以同宿主细胞产生电机械偶联，从而在移植细胞和宿主细胞之间产生同步收缩[11]。然而，分离不纯的ESC源性的心肌细胞移植后，可能形成畸胎瘤；而且伦理学一直是限制ESC临床应用的主要因素。（2）iPSC：通过逆转录病毒，将4种转录因子导入成熟细胞体内，可将该成熟细胞诱导成为多能干细胞[12]。该技术可以从自体成熟细胞诱导出自体多能干细胞，再诱导分化为目的细胞。但是探索能高效而经济地诱导出足够数量自体细胞方法一直是该技术的瓶颈；而且更为重要的问题在于，同成熟心肌细胞相比，由 iPSC 分化而来的心肌细胞尚不能达到完全、彻底的分化成熟状态，从而难以长期稳定地整合到心肌之中[13]。（3）成肌细胞：成肌细胞是在细胞移植心肌再生领域较早进行试验的细胞。然而，在第一个关于成肌细胞移植的随机对照试验MAGIC中， 结果令人失望。在接受心肌注入自体骨骼肌成肌细胞的患者中，心律失常的发生率明显增加[14]。故近几年，关于骨骼肌成肌细胞移植入心肌的研究相

对较少。（4）BMC：BMC包括EPC、MSC和HSC，他们可以在体外诱导分化为多种细胞，其中包括心肌细胞和血管内皮细胞[15]。BMC具有易于提取、可自我更新、同种自体的优势，在心血管领域的应用有较大优势。初期开展的一些临床试验（STAR、 TOPCARE-CHD、REPAIRE-AMI、TIME）以及 Meta分析也显示出BMC在心血管领域的应用具有不同程度的有效性[16, 17]。

2 旁分泌与干细胞

旁分泌： 一方面干细胞在心血管领域取得一定进展，另一方面也面临着诸多困难，如干细胞的预处理、遴选最佳的细胞类型、增加归巢、增殖、分化效率和建立细胞移植适应证等。因此更多的研究得以开展，以期探索干细胞在心血管领域具体的作用机制及临床效用。其中干细胞治疗中的旁分泌假说就是一个重要的理论进展。大量的试验研究表明，大多数移植入心脏的干细胞并未能存活很长时间，甚至没有观察到他们在心脏中的增殖[18]。因此在临床试验中所观察到的心功能的改善就不能完全用移植干细胞直接增殖分化而增加了心肌细胞数目这一假说来解释。旁分泌概念继而被提出，移植入心肌的干细胞可能会促进机体上调一些因子的表达，从而形成一个微环境，这个微环境一方面有利于原住的CSC和移植的心外干细胞激活、增殖、分化，还可以增强心肌细胞抗应激的能力[18-20]。BMC 移植中的缺血预适应这一技术手段，正是基于干细胞旁分泌概念的一个实际应用。 正是通过缺血预适应，增加了心肌中某些因子的表达，形成了一个有利的微环境， 从而提高干细胞归巢的效率[21]。然而目前尚不明确该微环境的具体成分，但其中一些重要的因子被相继提出，如心肌基质细胞衍生因子（SDF）、CXC趋化因子受体4（CXCR4）、血管内皮生长因子（VEGF） 等。

SDF-1α/ CXCR4：在旁分泌形成的微环境中，目前研究的较多的是 SDF-1α因子和它的受体 CXCR4。Abbott等[22]报道，在通过冠状动脉结扎诱导的小鼠心肌梗死模型中，梗死区域和梗死周围带中的 SDF-1α的 mRNA 和蛋白明显上调，同时血浆中的 SDF-1α下降。在静脉内注入骨髓单核干细胞（BMSC）48 h后，观察到同假心肌梗死组相比，有超过 （80.5±15.6）%的 BMSC 存在于梗死的心肌；另一方面，注入 SDF-1α同 CXCR4 结合的阻滞剂 AMD3100，心肌梗死后心肌组织对 BMSC 的募集下降了（64.2±5.5）%；再者，通过腺病毒转导，增加 SDF-1α可以显著增加 BMSC 在梗死区域的募集。此后，在很多心肌梗死的动物模型和缺血性心脏病的患者中，观察到了 SDF-1α/CXCR4 显著上调。表明他们在这类疾病中的重要病理生理作用。同时 SDF-1 α/ CXCR4 表达的上调可以使干细胞迁移至梗死区域，产生血管新生、心肌存活、心功能改善等生物效应[23]。这些都表明了 SDF-1α/CXCR4 在干细胞激活、归巢、增殖分化中扮演核心角色。

VEGF：Pons 等报道，长时间的培养，可增加MSC的细胞应激，而加入VEGF 后，则可以通过增加磷酸化 Akt 和抗凋亡蛋白（ Bcl-xL） 的表达，抑制细胞应激，增加 MSC 的增殖；另一方面，同单独注入 VEGF 或 MSC 相比较，同时注入VEGF 和 MSC 可以增加 MSC 在梗死心肌中的迁移 2～3 倍，更益于改善心脏功能[24]。此外，还有研究报道，增加的 VEGF可以通过 SDF-1α/CXCR4 途径激活 CSC，从而促进心肌组织的修复[25]。这些研究表明 VEGF 不论对于BMC还是原住的CSC而言，都是使他们归巢、激活、增殖、分化的重要因子。

3 心脏震波治疗（CSWT）与干细胞

CSWT 作为一种无创性新技术，核心是电磁式发生器，它由电磁线圈和金属膜组成,高频脉冲电流通过线圈时产生强磁场,强磁场产生的电磁能加速金属膜与线圈分离,由此产生缓慢的低压声学脉冲。低压声学脉冲经周围介质反射后向焦点汇聚并传递，其振幅在短短的几百纳秒中被非线性地增强，形成高能量冲击波。在组织中形成剪切力和空穴效应，二者使活体组织内气体形成微泡，这些微泡在震波作用下呈周期性的循环产生正负双向压缩运动，由此产生的一系列生物学效应。前期的动物实验和临床研究已经证实，CSWT 可以促进血管生成、抑制心室重构、改善左心室射血分数、抗炎、抗氧化等作用[26-28]。而这些作用机制与上文提及的干细胞微环境有着重要的内在联系。

CSWT与VEGF：Nishida 等[27]用不同能量级的震波干预人脐静脉内皮细胞，发现同对照组相比，能量在 0.09 mJ/mm2的震波显著上调了 VEGF mRNA 和 VEGF 受体 Flt-1 的表达。这个能量级相当于震波碎石能量的十分之一。Yip 等[29]用震波干预从 SD 大鼠中提取的骨髓源性的单核细胞（BMDMNC），发现在能量为0.09 mJ/mm2的 280 次震波下，同其他能量级以及对照组相比，能显著增加 VEGF 水平，此外还能增加新生 CD31+细胞的数目。表明震波不仅能促进 BMDMNC 表达VEGF，还能促进 BMDMNC 分化为内皮细胞。

CSWT 与 SDF-1α/CXCR4：Fu等[26]报道用缩窄器置于迷你猪前降支中段，建立心肌缺血模型。用心脏震波以0.09 mJ/mm2，800 次脉冲治疗心肌缺血区域 3个 月。 结果显示震波干预下的心肌中，SDF-1α/CXCR4 的 mRNA 和蛋白都显著高于假性震波组；用免疫荧光标记的 SDF-1α、CXCR4阳性细胞也显著高于对照组；在震波区域显示出更高的血管密度和更低的纤维化程度。

CSWT 与心肌前体细胞：Nurzynska等[30]分别从人健康的心脏和缺血性心肌病的心脏中取材活检， 分离出心肌、平滑肌、血管内皮细胞的前体细胞，用 CSWT 干预这些细胞，发现同对照组相比，不论是生理还是病理情况下，CSWT 都能促进这些前体细胞的增殖和分化。而且在健康心脏中，CSWT的这种促进作用更加明显，表明 CSWT 可以通过促进原住于心肌的前体细胞增殖、分化，在心力衰竭（心衰）的早期可能更能抑制心室重构。

CSWT 与 BMC：CELLWAVE试验是以慢性心衰患者为对象，将 CSWT 与BMC相结合，在德国开展为期 5 年的双盲、安慰剂对照试验。该试验招募了 102 例心衰患者，单盲给予左心室前壁 CSWT 或假震波干预，24 h之后又随机、双盲地分为冠状动脉内注入 BMC 组和安慰剂组。主要终点为左心室射血分数的改善；次要终点为核磁共振成像（MRI）所反映的心室壁厚度和主要心血管不良事件。结果显示：CSWT+BMC治疗同对照组相比可以显著改善左心室射血分数， 且主要不良心血管事件的发生率降低[31]。

综上所述，干细胞在心肌再生方面运用成败的关键在于通过旁分泌形成一个有益于干细胞激活、归巢、增殖、分化的微环境，而 SDF、CXCR4、VEGF 等因子正是该微环境中的核心要素。CSWT 已证实具有促进血管生成、抑制心室重

构、改善左心室射血分数、抗炎、抗氧化等作用，而这些作用的机理之一正在 CSWT 上调了 SDF、CXCR4、VEGF的表达。目前已开始零星出现将 CSWT 同干细胞联合治疗心血管疾病的研究，这些研究也都提示了二者结合更具优势。因此可以预见，CSWT 同干细胞相结合运用于心血管疾病将会是一个极具吸引力的领域。但在此之前，仍须高质量的研究来阐明干细胞在心肌再生方面精确的作用机制；旁分泌所形成的微环境的具体成分和作用机理；心脏震波治疗对干细胞归巢、激活、增殖、分化的作用机制。

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2014-06-11）

（编辑：梅 平）

国家自然科学基金（81260027）

650032 云南省昆明市, 昆明医科大学第一附属医院 云南省心血管研究所 心内科

王静 博士研究生 主要研究方向为介入心脏病学 Email：wangjing.md@hotmail.com*周超为共同第一作者 Email：zhouc2009@126.com

郭涛 Email：guotao20@hotmail.com

R541.4

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1000-3614（2015）06-0602-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.024