川崎病免疫功能和炎症因子检测及临床意义

沈方方，章爱莲，朱 雯，滕懿群

(嘉兴市第二医院，浙江 嘉兴 314501)

川崎病免疫功能和炎症因子检测及临床意义

沈方方，章爱莲，朱 雯，滕懿群

(嘉兴市第二医院，浙江 嘉兴 314501)

目的 分析川崎病免疫功能及炎症因子，探讨细胞免疫、体液免疫及炎症因子在川崎病中的机制及临床价值。方法 对56例川崎病患儿及50例健康对照组儿童测定免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、补体C3、补体C4水平，用流式细胞仪免疫荧光法检测CD3+T细胞百分比(CD3+%)、CD4+T细胞百分比(CD4+%)、CD8+T细胞百分比(CD8+%)、CD4+/CD8+、CD19+T细胞百分比(CD19+%)、自然杀伤细胞百分比(NK%)。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)。统计学方法采用2个独立样本t检验。结果 56例川崎病与50例健康对照组比较，CD8+%明显降低，CD4+/CD8+比值倒置、CD19+%明显升高，NK%降低，IgG升高，均具有统计学意义(t值分别为5.31、6.12、4.65、5.51、2.13，均P<0.01)。18例患儿急性期TNF-α、IL-6、IL-10较恢复期明显升高，差异均有统计学意义(t值分别为2.59、2.60、2.53，均P<0.05)。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脉损害组较无冠脉损害组均明显升高，差异均有统计学意义(t值分别为4.13、2.77、6.11，均P<0.05)。结论 川崎病急性期存在细胞及体液免疫功能的紊乱，炎症因子参与了川崎病的发病机制。尤其是冠脉损害的KD患儿炎症因子显著升高。

川崎病；淋巴细胞亚群；炎症因子；肿瘤坏死因子α

川崎病(Kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种急性、自限性的全身血管炎性疾病，1967年由日本Tomisaku Kawasaki首次报道。一般认为它是一种自身免疫性疾病[1]。但是对川崎病患者细胞免疫和体液免疫功能异常的研究还没有一致的结论[2-3]。冠状动脉病变是其最严重的并发症，该病已逐渐取代风湿热成为我国小儿后天性心脏病的主要原因之一。明确该病的病因对于KD的诊断、特异性治疗及预防至关重要。KD的病因及发病机制目前仍不十分清晰。可能与以下因素有关，包括感染、遗传易感、病毒以及细菌超抗原致病学说等。关于KD发病机制的研究，目前主要集中于发病急性期的免疫系统高度激活和(或)免疫功能紊乱导致的血管炎损害。但关于淋巴细胞亚群、免疫球蛋白及炎症因子等在KD急性期改变的研究结论仍不一致[4-5]。本研究通过检测免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、IgA、补体C3、C4，T细胞亚群、B细胞、自然杀伤细胞(NK)及炎症因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)在KD急性期的变化，进一步探讨免疫细胞、免疫球蛋白及免疫炎症分子在KD发病机制中的作用，为临床及时诊断、合理治疗KD及预防冠状动脉出现并发症提供依据和指导。

1 资料和方法

1.1 一般资料

KD及冠状动脉扩张的诊断参照《诸福棠实用儿科学》。收集2012年1月至2014年12月在嘉兴市第二医院确诊为KD的临床资料56例为KD组，同期门诊健康体检者50例为对照。两组病例均签署知情同意书，且通过院伦理委员会同意该项研究。KD患儿中男性患儿为35例，女性患儿21例，男女比例为1.67：1；年龄在4个月～13.5岁，平均年龄为4.2±1.6岁。无冠脉损害(non-CAL)组48例，合并冠脉损害(CAL)组8例。

1.2 研究方法

采集56例KD患儿及健康对照组50例，入院次日(所有均未开始使用IVIG及阿司匹林治疗)静脉血测定淋巴细胞亚群：流式细胞仪为BD(Becton and Dickinson Company)的FACS CantoII，采用四色荧光标记技术。取新鲜全血50μL与试剂混匀后，4℃下避光孵育20min，然后加入溶血素2mL，再室温避光10min，待溶解红细胞后加缓冲剂离心5min洗涤2次，最后弃上清液，上机进行流式检测，用Diva软件分析。外周血测定免疫球蛋白。

炎症因子的测定：分别采集KD患儿18例(另2例治疗过程中转上级医院)IVIG治疗前，治疗后1周(恢复期)及正常健康儿童20例为对照组静脉血2mL，分离血清-80℃冰箱待用。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α、IL-6、IL-10，试剂盒购于上海巧伊生物有限公司，美国thermo scientific全自动酶标仪分析结果。

1.3 统计学方法

所有资料处理用SPSS 13.0软件包进行分析，检测结果以均值±标准差表示，经方差齐性检验后，采用2个独立样本t检验比较两组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴细胞亚群比较

KD患儿CD8+细胞比例明显降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明显升高，NK比例降低，与对照组比较均有显著性差异(均P<0.05)，见表1。

2.2 免疫球蛋白及补体比较

KD患儿IgG、C3较对照组明显升高，差异有统计学意义，见表2。

2.3 炎症因子测定

TNF-α、IL-6、IL-10浓度在KD急性期、恢复期较对照组均明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；IL-6在KD恢复期较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 KD急性期、恢复期与对照组TNF-α、IL-6、IL-10浓度比较(pg/mL)

Table 3 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 between KD acute phase, KD recovery phase and control group(pg/mL)

2.4 冠脉损害与无冠脉损害炎症因子浓度比较

TNF-α、IL-6、IL-10浓度在合并有CAL患儿较non-CAL均明显升高，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见表4。

表4 CAL组与non-CAL组 TNF-α、IL-6、IL-10浓度比较(pg/mL)

Table 4 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 concentr￣ations between CAL group and non-CAL group(pg/mL)

3 讨论

3.1 淋巴细胞在川崎病发病机制中的作用

KD的发病机制目前尚未阐明，目前研究主要集中于机体免疫失调以及由此导致的多系统炎症性损伤[6-7]。T细胞异常活化是KD免疫系统激活导致血管免疫损伤的始动环节和关键步骤。T淋巴细胞活化是体内特异性免疫应答的重要环节，在KD急性期和亚急性期，异常活化的T细胞和单核细胞释放大量的细胞因子和炎性介质，如IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等，损伤血管内皮细胞，损伤的内皮细胞又可能成为新抗原，刺激B细胞分泌自身抗体，从而使内皮细胞损害加重。淋巴细胞及其亚群在机体维持正常的免疫功能中有重要作用。CD4+细胞可以促进体液和细胞免疫，CD8+细胞则抑制其反应，正常情况下，CD4+/CD8+比值维持动态平衡，以保持机体免疫功能稳定，如果T细胞总数或CD4+/CD8+比值发生改变，则引起细胞免疫功能失调，发生一系列的病理变化。因此CD4+与CD8+T细胞的平衡在抑制肿瘤、抗感染和自身免疫病中起着重要作用。B细胞通过识别抗原后分泌免疫球蛋白进而介导体液免疫。CD19抗原是B淋巴细胞表面的特异性抗原，CD19抗原表达的量能够反映总B细胞。自然杀伤细胞对T、B细胞有协调作用，同时还能抑制B细胞的活化，调节抗体的产生。

本研究发现KD患儿CD8+细胞比例明显降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明显升高，NK比例降低，与对照组比较均有显著性差异。提示KD急性期免疫失调，CD8+抑制细胞功能相对低下，从而导致CD4、CD8比例失衡，NK细胞比例降低，对B淋巴细胞的抑制作用减弱，B细胞功能亢进，IgG升高，从而参与全身多系统损伤。与丁艳等[4]研究结果相符。

淋巴细胞亚群及免疫球蛋白在KD无冠脉损害组及合并有冠脉损害组均无统计学意义。但笔者发现合并有冠脉损害组IgG水平明显降低或明显升高，提示合并有冠脉损害者其免疫系统更加紊乱。但本研究病例数较少，仍需进一步大样本研究。

3.2 炎症因子在川崎病发病机制中的作用

多种炎症因子参与KD的发生发展[6]。IL-6主要由活化的单核巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞等分泌，为一种促炎细胞因子，它可促进B细胞分化Ig的分泌和再次免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞，协同Ig增强CTL中穿孔素基因表达，并增加T细胞IL-2产生和IL-2R表达。IL-10是具有多种生物学活性的细胞因子，它是T细胞介导免疫应答引起单核/巨噬细胞和淋巴细胞异常活化，激活B细胞后释放出来的一种炎性反应抑制因子。受损血管内皮在其刺激下，诱导血液中活化的淋巴细胞，单核细胞及血小板向受损血管表面聚集，引起血管壁更深的免疫损伤。TNF-α：KD急性期血浆TNF-α水平显著增高，作为一种主要的促炎性反应因子，高水平的TNF-α直接损伤血管内皮细胞，导致内皮功能失调甚至内皮细胞凋亡和坏死，使血管屏障作用严重破坏[8]。临床研究已经证实KD急性期存在TNF-α、白细胞介素等致炎因子的升高，而且升高的程度与冠状动脉瘤及以后冠状动脉狭窄的形成有关[9]。Hui-Yuen等在动物实验中证实了TNF-α是冠状动脉损害形成的必要条件。

本研究发现KD患儿急性期TNF-α、IL-6、IL-10较恢复期及健康对照组明显升高，差异均有统计学意义。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脉损害组较无冠脉损害组均明显升高，有统计学意义，与既往研究相一致[5]。提示炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10在川崎病的发生发展中，尤其是CAL中有重要作用。因此，在川崎病的患儿中早期检测上诉炎症因子，为早期诊断及治疗提供实验室依据。

KD患儿存在免疫紊乱，多种炎症因子参与KD的发展，而作为最活跃的致炎因子和炎症因子，TNF-α受到越来越多研究者的关注。Hui-Yuen等在动物实验中发现TNF-α在全身性的急性炎症反应后局限至冠状动脉，TNF-α可使冠状动脉淋巴细胞募集，导致弹力纤维降解，血管壁受损，导致川崎病特征性CAL。由此推断针对TNF-α的抗TNF-α治疗可以减轻炎症反应和保护冠状动脉损伤。Son等[10]及Ohashi等[11]学者发现在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)和甲泼尼龙抵抗的川崎病病例中使用抗TNF-α，如英夫利昔单抗有明显临床疗效且是安全的。因此，应用抗TNF-α治疗为IVIG无反映型川崎病的治疗提供了新的前景。

[1]Yeung R S.Kawasaki disease: update on pathogenesis[J].Curr Opin Rheumatol, 2010, 22(5):551-560.

[2]Suzuki H, Suenaga T, Takeuchi T,etal. Marker of T-cell activation is elevated in refractory Kawasaki disease[J].Pediatr Int,2010,52(5):785-789.

[3]Franco A, Shimizu C, Tremoulet A H,etal. Memory T-cells and characterization of peripheral T-cell clones in acute Kawasaki disease[J].Autoimmunity,2010,43(4):317-324.

[4]丁艳,尹薇,熊越华,等.川崎病患儿免疫功能的检测及临床价值[J].中华风湿病学杂志,2012,16(9):588-592.

[5]韩云坤,孙冰,李丽红,等.川崎病T细胞免疫及细胞因子变化的研究[J].中国实验诊断学,2011,15(9):1533-1536.

[6]Giordani L, Quaranta M G, Marchesi A,etal.Increased frequency of immunoglobulin (Ig)A-secreting cells following Toll-like receptor (TLR)-9 engagement in patients with Kawasaki disease[J].Clin Exp Immunol,2011, 163(3):346-353.

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[专业责任编辑：肖延风]

Immune function and inflammatory factor examination and their clinical significances in Kawasaki disease

SHEN Fang-fang, ZHANG Ai-lian, ZHU Wen, TENG Yi-qun

(JiaxingSecondHospital,ZhejiangJiaxing314501,China)

Objective To analyze the immune function and inflammatory factors in Kawasaki disease (KD) and explore the pathological mechanism and clinical value of cellular immunity, humoral immunity and inflammatory factors in KD. Methods The serum IgG, IgM, IgA and C3, C4 levels were detected in 56 children with DK and 50 healthy controls. Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD3+T (CD3+%), CD4+T (CD4+%), CD8+T (CD8+%), CD4+/CD8+, CD19+T (CD19+%) and NK (NK%). ELISA was used to detect TNF-α, IL-6 and IL-10. Independentt-testwas adopted to analyze data. Results Compared with 50 healthy controls, CD8+% decreased significantly, the ratio of CD4/CD8 inverted, CD19+% increased obviously, NK% declined and IgG rose in 56 cases of KD with statistical significance (tvalue was 5.31, 6.12, 4.65, 5.51 and 2.13, respectively, allP<0.01). In the acute phase, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were significantly higher than those in the recovery phase (tvalue was 2.59, 2.60 and 2.53, respectively, allP<0.05). In the coronary arterial lesion (CAL) subgroup, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were higher than those in the non-CAL subgroup, and the differences were significant (tvalue was 4.13, 2.77 and 6.11, respectively, allP<0.05). Conclusion The cellular immunity and humoral immunity disturbances occur in acute phase of KD, and inflammatory factors are important in the pathogenesis of the KD. KD cases with CAL have especially higher level of inflammatory factors.

Kawasaki disease (KD); lymphocyte subset; inflammatory factors; TNF-α

2015-02-16

嘉兴市科技局资助项目(2012AY1071-12)

沈方方(1984-)，女，主治医师，硕士研究生，主要从事儿童风湿免疫疾病诊疗工作。

滕懿群，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.029

R725

A

1673-5293(2015)06-1201-03