微小核糖核酸在急性心肌梗死诊断和治疗中作用的研究进展

摘要 近年来，随着分子生物学研究方法的飞速发展，急性心肌梗死（AMI）的机制研究在分子生物学水平取得了长足的进展。研究发现，微小核糖核酸（miRNA）表达异常在AMI发病过程中发挥了重要作用，并可能是AMI早期诊断的标志物以及潜在的治疗靶点。本文将重点介绍几种与AMI发病关系密切的miRNA，并将近年来miRNA作为AMI诊断标志物和治疗靶点的研究进展做一综述。

作者单位：730000 甘肃省兰州市，兰州大学第一医院 心血管内科 甘肃省心血管疾病重点实验室

作者简介：唐宇宁 硕士研究生 研究方向为动脉粥样硬化的基础与临床研究 Email:Tangyn.lzu@gmail.com 通讯作者： 张钲 Email:zhangccu@163.com

微小核糖核酸（miRNA）是一类大小为19～25个碱基的内源性非编码小RNA分子，研究表明编码蛋白的基因总数不到3万个，而非编码RNA基因约占整个人类基因组的98%，其中编码的miRNA超过1 000种，负责调控哺乳类动物编码基因的30% [1]。探讨miRNA在人类疾病中作用的研究始于白血病，其后对肿瘤、糖尿病以及免疫系统疾病均有研究。近年来，miRNA在心血管领域尤其是对急性心肌梗死（AMI）调控作用的研究取得了很大进展 [2, 3]。

1 微小核糖核酸在急性心肌梗死发病机制中的作用

miR-1和miR-133主要通过调节细胞凋亡来影响AMI发病过程中心肌细胞的存亡。多项研究表明，这两种miRNA 在AMI发生后短期内即持续显著升高。miR-1是一类肌细胞特异性miRNA，过度表达时可通过抑制下游增殖相关靶基因如RasGAP、Cdk9和Rheb的表达，进而抑制心室肌细胞增殖。Xu等 [4]在氧化应激诱导的H9c2大鼠心室肌细胞中发现，miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡。miR-1的靶点为热休克蛋白（HSP）60和HSP70基因的3'非翻译区，它能降低HSP60和HSP70蛋白水平，但不改变其转录；miR-133在整个Caspase-9基因序列中可能有多个靶位点，在蛋白和信使核糖核酸（mRNA）水平都能抑制Caspase-9的表达，这可能是细胞调节凋亡与存活的机制之一。研究显示，当心肌细胞处于促凋亡（如缺血和氧化应激）环境时，miR-1水平会病理性升高。

miR-499、miR-208a和miR-208b在不稳定性心绞痛和AMI发生时也显著增高。miR-499是由β-肌球蛋白重链基因Myh7b的19内含子编码的。基因敲除研究显示，miR-499和另一个心肌miRNA——miR-208b功能相似，都通过激活缓慢肌纤维基因和抑制快速肌纤维基因来调节肌球蛋白的表达，且两者均受miR-208a的调节 [5]。转基因过表达研究发现，miR-499能通过靶向调节亲肥大磷酸酶来发挥心肌保护作用 [6]，也能调节早期应激反应基因而使心脏功能障碍 [7]，因此，miR-499在心脏中的功能和它的调节基因表达的后果，目前还不清楚。人类肌肉富含miR-1、miR-133a和miR-499，而miR-208为心肌特异表达的miRNA，且在激素调节的心肌生长中起重要作用。miR-208来自于心肌特异α-主要组织相容性复合体（MHC）基因mRNA前体的第27个内含子。因此，位于内含子中的miRNA与其宿主基因由于来源于同一个转录本而有着相似的表达谱。研究者通过基因芯片分析心脏条件性miR-208敲除小鼠模型后发现，miR-208可能通过抑制正常心脏中不表达的快骨骼肌收缩蛋白基因来维持心肌细胞的收缩表型。进一步研究显示，在应激状态下，miR-208通过抑制靶基因甲状腺素受体相关蛋白1的表达从而调控心肌肥厚、纤维化以及β-MHC的表达。因此，α-MHC不仅仅只是心肌收缩蛋白，它还包括一个能够调控激素刺激的心肌生长和基因表达的miRNA。

作为miRNA中的一员，Let-7g能够调节转化生长因子-β （TGF-β）来对内皮细胞发挥保护性作用，同时可以抑制内皮细胞和平滑肌细胞摄取氧化型低密度脂蛋白，进而抑制动脉粥样硬化（AS）的发展。在体外实验中，Let-7g能抑制内皮细胞炎症，并通过下调TGF-β来抑制纤溶酶原激活抑制剂-1 （PAI-1）的表达，同时可增加同源基因的表达来降低内皮细胞的敏感性；在活体内，给高血脂的载脂蛋白E基因敲除小鼠注射Let-7g抑制剂会增加TGF-β诱导的基因（包括PAI-1基因）在血管内的表达，增强巨噬细胞在颈动脉的渗透性，并导致颈动脉内膜中层增厚；腔隙性脑卒中患者的血清Let-7g低水平与血浆PAI-1高水平有关。由此推论，Let-7g可能是内皮细胞炎症的关键内生抑制剂，当缺乏Let-7g时，内皮细胞获得促炎性表型，引发血管损伤并激活血小板 [8]。

2 微小核糖核酸在急性心肌梗死诊断中的作用

血清miRNA被认为是一种理想的诊断标记物，因其与血浆中的囊泡、高密度脂蛋白胆固醇、Ago2蛋白以及核仁磷酸蛋白1等形成复合物，或存在于凋亡小体中而十分稳定，能承受住反复的冻结—融解循环，并能抵抗核糖核酸酶的降解 [9]，且血浆中miRNA水平不受临床相关因素的影响，如年龄、性别、体重指数、肾功能、收缩压以及白细胞计数等。此外，血清miRNA具备标志物的大多数特点：无创检测、高敏感度和特异度、病变早期即可检测到、随病变程度有时间性的改变、半衰期长且检测迅速等。

Liebetrau等 [10]对肥厚型梗阻性心肌病患者采用经冠状动脉的室间隔肥厚消融术，得到了冠状动脉闭塞后循环中特定miRNA的出现时间。在冠状动脉闭塞后仅仅15 min，miR-1和miR-133浓度就开始上升，且在74 min达到平台期，这可能能为非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的早期识别作出贡献。Wang等 [11]用反转录—多聚酶链式反应检测了AMI患者在发作24 h和6 d后的全血和血浆中miR-133和miR-328水平，发现这两种miRNA在AMI患者血浆中的水平均显著高于正常对照组人群。另一研究发现，STEMI患者体内miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-499-5p会迅速上调，其中miR-133a最显著，与对照组相比升高了140倍 [12]。 有研究表明，miR-133a在STEMI患者体内浓度升高与大面积心肌梗死、心肌再灌注损伤以及心肌挽救减少有关 [13]。miR-1、miR-133a和miR-133b升高和达峰时间与心肌肌钙蛋白I同步，miR-499-5p则稍微滞后，在发病第5 d时miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-499-5p和miR-375都恢复到正常水平，而miR-122直至第30 d仍未恢复 [14]。

miR-1、miR-133a和miR-208a能在AMI发生4 h内持续性升高，在心肌肌钙蛋白T前达到高峰，先于传统标志物。miR-208a尤其适合作为标志物，因为它是心脏特异的，在健康人群和非AMI患者血浆中为阴性，而在AMI患者中检出率高达90.9%，而miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208b和miR-499在不稳定性心绞痛和AMI患者中均可检测到。在冠状动脉闭塞1 h后，miR-208a即显著升高并可检出 [15]。因此，miR-208a对AMI的诊断具有较高的敏感性和特异性。此外，有研究者比较了NSTEMI老年患者和急性心力衰竭但不伴有AMI的老年患者血浆中miRNA水平，结果发现，NSTEMI患者血浆中miR-1、miR-21和miR-133a显著高于正常对照人群，且 miR-21和miR-499-5p水平显著高于急性心力衰竭组，其诊断的精确性高于高敏心肌肌钙蛋白T。

Vogel等 [16]研究了全基因组miRNA的动力学改变，发现有多种miRNA可能是AMI的标志物，提示我们或可用一组miRNA来作为AMI诊断标志物，如联合检测miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-208a，以提高准确性。未来需要更多的研究来确定哪些miRNA在早期诊断方面可优于肌钙蛋白，尤其是在肌钙蛋白边界性升高、心电图改变和症状不典型的患者，以及AMI的排除诊断。然而，miRNA的靶作用具有多效性，它的特异性到底能否优于高敏心肌肌钙蛋白，目前还未可知。用外周血miRNA作诊断标志物还有许多问题亟待解决，如抗凝药和抗血小板药物对miRNA的干扰；此外，miRNA在血清、血浆和全血中均稳定存在，但在RNA分离和多聚酶链式反应定量分析中会逐渐减少，有学者认为血清可能是最适样本，因为血清可以避免白细胞导致的偏倚；另一个重要的问题是，miRNA的检测技术需要标准化，有研究用miR-17来标化样本 [12]，然而另有研究表明miR-17在急性冠状动脉综合征患者体内也有升高 [17]，且已知miR-17-92簇受局部缺血和炎症因子的调节，因此miR-17用于标化的准确性也有待商榷。此外，多聚酶链式反应技术也是限制miRNA应用的一个重要方面，miRNA序列的扩增依靠寡核苷酸，然而扩增时如果滴定不当可能导致伪影，数字多聚酶链式反应能相对提高miRNA定量的精确度。最后，以目前的技术水平，miRNA的分离以及随后的反转录—多聚酶链式反应定量仍需大量时间，要使miRNA广泛用于临床，需迅速有效得出结果，即最好能在床旁检测。

关于miRNA能否作为AMI的预后指标，目前知之甚少。有研究检测了AMI患者的6种肌肉中富集的miRNA，发现与稳定性心绞痛患者相比，AMI患者的miR-1、miR-133a 和miR-208b水平显著升高；单因素分析揭示，miR-133a和miR-208b水平与死亡风险显著相关 [18]。但是，经高敏心肌肌钙蛋白T调整后并未发现独立的预后意义。

3 微小核糖核酸在急性心肌梗死治疗中的作用

心脏miRNA能够影响细胞死亡、心肌电生理功能、心肌原始细胞增殖和分化、血管生成以及细胞外基质成分，因此，针对miRNA的治疗能够为改变AMI的病理生理过程提供机会。以miRNA 为靶点设计药物，补充表达下调的miRNA 或抑制过多表达的miRNA，将可能有效阻止AS的进展，同时也为AMI治疗带来新希望。如前文中提到的，既然Let-7g能抑制内皮细胞炎症，Let-7g类似物很可能对AS发挥治疗作用。此外，在载脂蛋白E敲除的小鼠体内，miR-181b能抑制炎症和AS，miR-146也可抑制内皮炎症激活，故而补充miR-181b或miR-146也可能起到抑制AS的作用。miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡，这提示miR-1和miR-133的相对水平比绝对水平更重要：升高miR-1和（或）降低miR-133水平有利于细胞凋亡，减少miR-1和（或）增高miR-133水平有利于存活 [4]，调节miR-1与miR-133的相对水平，也可起到提高心肌细胞存活率的作用。

miRNA在治疗方面的探索主要通过过表达和抑制途径,使用病毒载体生产miRNA以及寡核苷酸miRNA类似物的研究仍在进行。与之相比，用反转录方法来抑制基因表达的研究更为成熟：通过化学修饰作用，提高miRNA拮抗剂（反义寡核苷酸）与miRNA的亲和力，并获得核酸酶抵抗性、蛋白结合能力（硫代磷酸酯主链连接）和细胞摄取能力（2'-O-甲基-胆固醇-共轭）。锁核酸是8个或15个碱基的反义分子，具有2'修饰的糖基（2'-氟和2'-O-甲氧基乙基），使其对靶序列的亲和力明显升高。但有报道提出，锁核酸能诱导补体级联反应、激活固有免疫并有肝毒性 [19]。

由于miRNA靶作用的多效性，它们对人体的调节作用是不可预估的，还有诸如miRNA类似物的精确调节、根据不同个体危险因素的miRNA拮抗剂的生产等多个问题并未解决，对其进一步研究将丰富我们对心血管生理和疾病的认识，并推动和拓展心血管疾病的治疗思路和方法。

4 小结与展望

miRNA在AMI发生过程中发挥重要作用，但尚需更多研究来深入探讨miRNA的作用范围、对miRNA活性的干预措施的安全性，以及这些基础研究在具体疾病中的实际应用价值。同时，由于目前临床研究中所纳入研究样本量过小，很可能产生偏倚，故需要更多更大样本量的临床研究来鉴别多样化的miRNA在心血管疾病中的特异表达，为AMI的诊断和预后提供理想的分子标志物，并探索如何通过调节miRNA水平来达到治疗的目的。