蜂胶抗病原微生物的活性物质及其作用机制

曹雪萍　申小阁　胡福良

（浙江大学动物科学学院，杭州310058）

蜂胶抗病原微生物的活性物质及其作用机制

曹雪萍申小阁胡福良

（浙江大学动物科学学院，杭州310058）

抗病原微生物作用是蜂胶最重要的生物学活性之一。蜂胶抗病原微生物的活性物质及其作用机制是蜂胶抗病原微生物活性研究的热点。本文对近十多年来蜂胶抗病原微生物的活性物质，以及蜂胶在破坏菌体细胞膜及细胞壁的完整性、抑制细菌生物膜形成、抑制细菌毒力因子活性和其相关基因表达等作用机制的相关研究进展进行综述，以期为蜂胶抗病原微生物活性的进一步研究及开发利用提供参考。

蜂胶；抗病原微生物；活性物质；作用机制

蜂胶的化学成分极为复杂，生物学活性十分广泛，其中抗病原微生物作用是蜂胶最重要的生物学活性之一。蜂胶抗病原微生物活性的研究与应用的历史十分悠久。近十多年来，随着人们对蜂胶关注度的逐渐升高，大量围绕蜂胶抗病原微生物活性的相关研究也随之展开，其中蜂胶抗病原微生物的活性物质及其作用机制是研究的热点。本文对近十多年来蜂胶抗病原微生物的活性物质及其作用机制的相关研究进展进行综述，以期为蜂胶抗病原微生物活性的进一步研究及开发利用提供参考。

1　蜂胶抗病原微生物的活性物质

蜂胶成分极为复杂，并且针对不同种类的微生物，其发挥活性的主要成分也有所差异。关于蜂胶中具有抗微生物作用的活性物质研究有很多，主要以抗菌活性成分的研究为主。这些活性成分种类众多，包括黄酮类、萜烯类和酚酸类等。

乔智胜和陈瑞华［1］对河南蜂胶抗菌活性成分进行了研究，从蜂胶乙醇浸提液中分离到3个具有抗菌活性的结晶，经鉴定分别为芥子酸、异阿魏酸和咖啡酸，从醇提液中还分离得到白杨素。蜂胶中含有多种抑制金葡菌生长的成分，然而单体成分的最小抑菌浓度（MIC）与蜂胶本身相近或略高，说明蜂胶对金葡菌的抗菌作用是多种成分协同作用的结果。

Amoros等［2］通过实验确定了蜂胶中抗1型单纯疱疹病毒的主要黄酮性成分，并发现黄酮醇的活性要强于黄酮的活性，活性顺序为高良姜素＞山奈酚＞槲皮素，表明这些抗病毒成分之间还存在协同作用，后来Lyu等［3］的实验也进一步证实了Amoros等的结论，并发现受试的黄酮类成分对1型单纯疱疹病毒的作用强于对2型单纯疱疹病毒的作用

Velikova等［4］从巴西本地的一种无刺蜂（Melipona quadrifasciata）采集的蜂胶中分离出3种贝壳杉烯，而其中异贝壳杉烯酸与蜂胶总提取液具有相近的抗金葡菌的能力，说明这种物质在巴西无刺蜂蜂胶的抗菌活性中起到非常重要的作用。

Bosio等［5］从意大利西北部的不同地区采集到两种蜂胶样，用46种化脓性链球菌菌株检测其抗微生物活性。通过琼脂稀释法和琼脂扩散法，得到MIC和最小杀菌浓度（MBC）不超过234 μg/ml，其中的一种蜂胶抗菌作用更好，HPLC分析发现这个样品提取物中含有更多的黄酮类成分松属素和高良姜素。Koo等［6］研究了蜂胶组分对变形链球菌生长和葡糖基转移酶（GTFs）活性的影响，通过评估蜂胶中已发现的几种不同化学组分对溶液中和唾液包被的羟基磷灰石珠子表面的葡糖基转移酶活性的影响。结果表明，黄酮和黄酮醇是溶液中葡糖基转移酶强有力的抑制物，而对不可溶性酶则效果较差。芹黄素（4，5，7-三羟基黄酮的一种）是最有效的GTFs抑制物，无论是在溶液中（浓度为135 μg/ml时达到90.5～95%抑制）还是在sHA珠子表面（135 μg/ml时达到30～60%）；通过MIC、MBC和Time-kill研究抗菌活性，结果表明，黄烷酮类和一些二氢黄酮醇以及倍半萜烯tt-法尼醇能抑制变形链球菌和血链球菌的生长，tt-法尼醇是最有效的抗菌成分，其MIC和MBC分别为14～28 μg/ml和56～112 μg/ml。

Kartal等［7］对土耳其安纳托利亚喀山和马尔马里斯地区蜂胶样品的抗菌活性进行了评估，研究表明其抗菌活性主要与蜂胶中的咖啡酸及其脂类有关，并从喀山蜂胶样中分离出了包含3，3-二甲基咖啡酸烯丙酯和3-异戊烯咖啡酸酯两个同分异构体混合物，这个混合物具有良好的抗菌活性。Popova等［8］的实验表明酚类黄酮类物质对蜂胶发挥抗菌作用的重要性，因为总黄酮和总酚含量低的样品，其所需抗菌浓度会偏大，只有其中一种样品比较特殊，可能是其内含有的二萜酸帮助其发挥了抗菌活性。

de Paula等［9］研究了产自巴西的蜂胶乙醇提取物（EEP）和单体成分对16种口腔致病微生物的抗微生物活性，发现所有受试微生物都会受到EEP的影响，但没有哪一种单体成分的活性强于提取物，表明蜂胶抗微生物的作用是各种物质的协同作用。Gonsales等［10］研究表明，EEP能有效抑制革兰氏阳性菌，而且抗菌能力与黄酮含量呈正相关。Melliou等［11］（2007）研究表明蜂胶挥发油中含有的萜类物质具有很好的抗菌和抗真菌活性。Campana等［12］分析了两种EEP和几种黄酮成分对临床分离的16种人空肠弯曲杆菌和几种革兰氏阳性及阴性病原菌的抗菌活性。结果表明，EEP能抑制空肠弯曲杆菌、粪肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，活性最强的黄酮类成分是高良姜素；空肠弯曲杆菌对其敏感度达到68.8%，槲皮素的活性稍差（50%）；EEP对人空肠弯曲杆菌的MIC为0.3125～0.156 mg/ml，高良姜素和槲皮素的MIC为0.250～0.125 mg/ml。

Trusheva等［13］从伊朗蜂胶中分离出5种单体成分，其中4种为萜脂：bornylp-hydroxybenzoate、bornylvanillate、ferutinolp-hydroxybenzoate和ferutinol vanillate，均具有抗金黄色葡萄球菌的活性。这些抗菌成分属于苯甲酸类单萜和倍半萜烯脂类物质。

Ordónez等［14］研究了从阿根廷北部采集的蜂胶对一些植物病原菌的抗菌活性。结果表明，活性最强的蜂胶来自图库曼省，并从中分离出抗菌活性成分2.4-二羟基查耳酮，其抗菌作用比EEP还有效（MIC分别为0.5～1.0 μg/ml和9.5～15.0 μg/ml）。植物毒性试验结果表明，蜂胶提取物不会延迟莴苣种子的发芽和洋葱根的生长；蜂胶溶液喷洒在感染了丁香假单胞菌的西红柿上能降低病坏程度，表明蜂胶在防治水果病害上可能很有前景。

de Aguiar等［15］评估了3种巴西蜂胶提取物对瘤胃内一些细菌的作用，发现蜂胶提取物能抑制一些细菌的生长，但也有一些微生物对蜂胶提取物表现为耐受，被抑制的细菌对蜂胶提取物的敏感性不同，酚含量最低的提取物抗菌活性也最差。通过对蜂胶提取物中主要酚类化合物柚皮素、柯因、咖啡酸、p-香豆酸和阿替匹林C对4个敏感菌株抗菌活性的评估，发现只有柚皮素对所有菌株表现出抑制活性，表明柚皮素是参与蜂胶抗菌作用的重要成分之一。Navarro-Navarro等［16］通过肉汤宏稀释法对墨西哥西北部索诺兰沙漠3个不同地区的蜂胶抗弧菌属抗菌活性的研究，发现产自乌雷斯地区蜂胶的抗菌活性最强，对大多数受试菌的半数最低抑菌浓度（MIC50）小于50 μg/ml，而且呈浓度依赖性。该蜂胶成分中的高良姜素和咖啡酸苯乙酯具有强烈抑制细菌生长的活性，MIC50为0.05～0.10 mmol/L。

由此可见，蜂胶中含有多种已经证实的抗病原微生物成分，如松属素、高良姜素、山奈酚、槲皮素、芹黄素、咖啡酸苯乙酯、柚皮素、异阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、苯甲酸类单萜和倍半萜烯脂类物质等。此外，还有文献报道了蜂胶中其他具有抗病原微生物作用的成分：球松素、杨芽黄素、对香豆苯酸酯、短叶松素、白杨素、靛红山姜素短叶松黄烷酮、乔松酮、柯因以及某些蜂胶中特有的活性成分，如巴西绿蜂胶中的3-异戊二烯基-4-羟基肉桂酸、2，2-二甲基-6-羧乙基香豆素、3，5-二异戊二烯基-4-羟基肉桂酸（阿替匹林C）、2，2-二甲基-6-羧乙基-8-异戊二烯基香豆素等［17，18］。

2　蜂胶抗病原微生物的机制

蜂胶的抗菌活性虽然很早便被人们发现，但在早期，其抗菌作用的确切机制一直不清楚，只是简单地将其归结为各种物质的协同作用。近年来，随着研究的不断深入，对蜂胶抗菌机制的探索有了初步的进展。蜂胶抗病原微生物的机制有以下几方面：

2.1抑制细菌生物膜形成，影响细菌的生长和黏附

朱明等［19］研究了不同浓度新疆黑蜂胶对大肠杆菌体外培养生物膜形成及清除的影响，结果表明，新疆黑蜂胶醇提物对大肠杆菌的MIC为12.50 g/L，当浓度为6.25 g/L时新疆黑蜂胶就可在早期呈剂量依赖性干扰细菌生物膜的形成，当浓度达到50.00 g/L时，其抑制生物膜的作用与庆大霉素无显著差异；当蜂胶浓度达12.50 g/L时，能有效清除成熟生物膜，而当浓度达到50.00 g/L时，其清除成熟BF的作用与庆大霉素无显著差异。

Wojtyczka等［20］利用表皮葡萄球菌研究波兰蜂胶的抗菌活性，结果表明，波兰蜂胶乙醇提取物在浓度为0.39～1.56 mg/ml时能抑制此菌的所有受试菌株的生物膜形成；EEPP的MIC范围为0.78～1.56 mg/ml，平均MIC为1.13±0.39 mg/ml。然而，EEPP浓度为0.025～0.39 mg/ml时，经过12 h和24 h的孵育，反而能促进此菌的增殖。总的结果分析表明，EEPP的抗菌活性表现为细菌生长的抑制，生物膜形成能力的抑制，以及增殖的强度明显受到孵育时间、EEPP浓度以及这些因素之间相互作用的影响。

Koo等［21］研究发现，蜂胶中的黄酮和黄酮醇能有效抑制变形链球菌葡糖基转移酶活性，其中芹黄素最为有效。蔡爽等［22］采用纸片琼脂扩散法观察了10、25、50和100 g/L蜂胶防龋涂膜对变形链球菌c型和d型的抑菌作用，结果表明各浓度蜂胶涂膜及基质都能够抑制细菌生长和黏附，且抑菌作用呈明显的浓度依赖性，100 g/L涂膜组的抑菌效果与1.6 g/L洗必泰溶液无显著性差异。

Scazzocchio等［23］研究了EEP亚抑菌浓度的抗菌活性及其对一些抗生素抗菌作用的影响，还研究了EEP亚抑菌浓度对金黄色葡萄球菌一些重要的毒力因子，如脂肪酶、凝固酶的作用，以及对其生物膜形成的影响。结果表明，EEP对所有受试的临床菌株都有很好的抗微生物活性。而且，EEP能大大增强一些抗菌药物如氨苄西林、万古霉素、头孢曲松等的作用，但不能增强红霉素的作用，而同样的EEP浓度能抑制一些葡萄球菌的脂肪酶活性和凝固酶活性和生物膜的形成。

张秀喜［24］的研究表明，蜂胶可使金黄色葡萄球菌和大肠杆菌碱性磷酸酶和β-半乳糖酸酶在胞外溶出，且对金黄色葡萄球菌的作用比大肠杆菌的要强，其抑菌机理表现为使细菌细胞壁和细胞膜的通透性增大。

2.2破坏菌体细胞膜及细胞壁的完整性，使细菌内容物外流

Tim和Lamb［25］通过比较金黄色葡萄球菌细菌悬浊液中钾流失状况，以研究高良姜素对细菌细胞膜完整性的影响。结果表明，高良姜素、抑菌抗生素新生霉素和青霉素G对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus NCTC 6571）的MIC分别为50 μg/ml、62.5 ng/ml和31.3 ng/ml，当5×107cfu/ml的金黄色葡萄球菌在包含50 μg/ml的高良姜素的无钾培养介质中12 h后，细菌活力下降了60倍。1×109cfu/ml的金黄色葡萄球菌在含有50 μg/ml的高良姜素条件下孵育12 h后，比空白组多流失了21%的钾；新生霉素并不会造成钾流失，而细菌孵育在含有31.3 ng/ml的青霉素G培养介质中会有6%的钾流失。这些数据表明，高良姜素造成的钾流失可能是由于它对细菌细胞膜造成直接损伤或通过自溶作用造成间接损伤，即损伤细胞壁以及接下来的渗透性溶解。

2.3抑制细菌毒力因子活性和其相关基因的表达，使其侵袭力和毒力下降

姜游帅［26］研究了蜂胶对金黄色葡萄球菌毒力因子抑制作用，结果表明蜂胶能抑制金黄色葡萄球菌ATCC29213生长，MIC为512 μg/ml，并且亚抑菌浓度蜂胶能降低金葡菌溶血活力和凝固酶效价，降低金葡菌肠毒素A、肠毒素B及α-溶血素表达量；在基因水平上，亚抑菌浓度蜂胶能减少α-溶血素基因hla和Agr二元调控系统的agrA mRNA表达量，而Agr二元调控系统对金葡菌对数生长后期分泌的许多毒力蛋白有调控作用，对α-溶血素起到正向调控的作用。因此，预测蜂胶降低α-溶血素的表达部分依赖于抑制Agr二元调控系统。

3　研究展望

尽管蜂胶抗病原微生物机理上的研究已经取得一定进展，但研究还是偏少且不够深入。蜂胶化学成分复杂，其抗菌机理也必然多样，所以很值得进行更深入的研究。

蜂胶中丰富的黄酮及萜烯类物质对抗菌活性的发挥起到很大的作用，而黄酮及萜烯类物质的抗菌机制主要存在以下几种［27］：（1）损伤细菌细胞质膜；（2）抑制细菌核酸合成；（3）干扰细菌的能量代谢；（4）抑制细菌细胞壁的形成；（5）抑制细菌细胞膜的形成。这些研究对蜂胶抗菌机制的深入研究有一定的参考意义。然而需要注意的是，由于一些实验设计的不合理，或对实验数据、实验现象理解的不当，一些实验结论可能需要进一步验证。例如，黄酮的抗菌机制到底是一种还是多种存在争议，因为机制研究实验中，存在将原因与结果混淆的可能。例如，抗菌成分损伤了菌体细胞膜，会扰乱质子动力势，而这会进一步影响ATP产生和物质转运。如果菌体细胞产生能力和摄取营养物质的能力受到影响，紧接着便会影响其核酸、肽聚糖等合成的能力，这种情况下，单一的作用机制有可能被误解为多种作用机制。蜂胶作为一种成分极为复杂的混合物，不同的成分其抗菌机制可能不同，有些成分由于结构的相似性，也可能具有相同的抗菌机制，所以对其抗菌机制的研究最好能建立在对其单体抗菌成分的研究之上，进一步研究蜂胶及其成分究竟是通过以上所提到的一种还是多种机制发挥抗菌作用的。

此外，值得注意的是，关于蜂胶的抗菌研究，大多研究结果表明其对革兰氏阳性菌的作用强于对革兰氏阴性菌的作用，具体机制尚不是特别清楚。可能是革兰氏阴性菌复杂的外膜结构不利于蜂胶进入胞内发挥作用，也有可能是于一些革兰氏阴性菌特殊的耐药机制，如主动外排系统［28］。有文献表明存在于革兰氏阴性菌细胞膜的外排泵系统AcrAB-TolC（存在于肠科杆菌）及MexAB-OprM（存在于绿脓杆菌）与革兰氏阴性菌对大多数植物成分耐受有一定关系［29］。而大肠杆菌及绿脓杆菌等阴性菌对蜂胶比较耐受的机理可能与此有很大的关系，有待进一步研究。

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国家蜂产业技术体系专项资金（CARS-45），上海市科技兴农重点攻关项目［（2014）第6-1-1号］

胡福良，E-mail：flhu@zju.edu.cn