辽宁省首次发现黑蜂王台病毒病

袁春颖　侯春生　李贝贝　熊成　刁青云

（1辽宁省畜产品安全监督察所，兴城125100；2中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

辽宁省首次发现黑蜂王台病毒病

袁春颖1侯春生2李贝贝2熊成1刁青云2

（1辽宁省畜产品安全监督察所，兴城125100；2中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂病毒病是危害蜜蜂健康的重要病原之一。鉴于辽宁地区部分蜂场蜂群突然大量死亡或新出房蜂不能参加采集任务的现象，通过在发病蜂场采样，采用RT-PCR方法进行病毒检测，发现黑蜂王台病毒（Black queen cell virus，以下简称BQCV）普遍存在于大量死亡蜂群。进化分析显示，BQCV辽宁株与吉林株、韩国株相近，表明此毒株与亚洲株最相近。推测黑蜂王台病毒可能是导致蜂群大量死亡的重要原因之一，为进一步探讨病原防治提供基础。

黑蜂王台病毒病，PCR鉴定，蜂群大量死亡

1　引言

辽宁省山区众多，蜜源丰富，尤其是荆条蜜是我国优质蜂蜜之一。但近两年来，蜂群遭受了严重的损失，尤其是今年春季，大部分蜂场均有报道蜂群突然死亡或新出房幼蜂不能飞翔，于箱门前乱爬。前期调查研究中，曾在中华蜜蜂群中检测到中蜂囊状幼虫病毒［1］，自此，病毒病在辽宁地区的蜂群开始引起关注。同时，另一个病毒，黑蜂王台病毒，由于其感染子一代的能力较强，对蜂群的危害尤为严重。BQCV在世界许多国家及我国蜂场均有报道，但大多是西方蜜蜂感染此病较多，并且该病毒大多时候处于隐性感染状态，即看似健康的蜜蜂可能已经感染此病毒，而未被激活。黑蜂王台病毒首次于发育的蜂王病蛹中发现而得名［2］。最初，BQCV主要引起蜂王幼虫死亡，后来发现普遍存在于成蜂及幼虫体内［3］，进一步研究又发现感染微孢子虫的蜜蜂更易检测到BQCV［4］。BQCV不仅能垂直传播，而且能水平传播，由于蜂王是唯一产后代的个体，因此对整个蜂群的危害是相当严重的。

在国外，Allen［5］等人最先报道了BQCV的基本特征及分布，随即又发现微孢子虫与BQCV的互作将极大增强了BQCV的致病力［6］，继而发现其他寄生，如蜂螨也能有效传播BQCV，并增强其危害性［7］。2000年，BQCV的全基因组序列公布［8］，大大推动了BQCV的研究进展。继而在我国蜂群中也普遍检测到BQCV的存在［9-11］。最近，杨倩等［12，13］报道BQCV吉林株的全基因组序列，为深入研究BQCV的分布及危害奠定基础。近两年辽宁省部分蜂群发病频率较高，原因未明，还未见在辽宁有BQCV报道。本研究通过采集病蜂样本，采用RT-PCR方法检测病毒BQCV，为探明BQCV在辽宁地区的危害及分布奠定基础。

2　材料与方法

2.1样本采集

采自辽宁省不同地区近15个蜂场的健康蜂及巢门前的爬蜂，样品的采集是基于蜂农发现蜜蜂大量死亡或爬蜂，采集的样品快速冷冻低温保存。蜂种主要包括意大利蜜蜂和中华蜜蜂。

2.2RNA提取

将大约20只蜜蜂置于15 ml无菌管中，在组织匀浆设备进行研磨，至细末状，加入适量的Trizol总RNA提取试剂，室温放置10 min后，于12000 rpm下离心15 min，取沉淀加入1 ml 75%酒精清洗，详细步骤按RNA提取试剂盒说明操作。提好的总RNA溶解于20 μl的TE缓冲液并贮存于-20℃冰箱中备用。

2.3RT-PCR

PCR反应总体积为20 μl。其中提取蜜蜂的总RNA为模板，以Takara反转录试剂盒进行反转录，2×Taq Mix（天根，北京）及引物“TGG TCA GCT CCC ACT ACC TTA AAC”和“GCA ACA AGA AGA AAC GTA AAC CAC”产生677 bp的片段［14］。扩增反应体系为：cDNA模板为1 μl，上、下游引物各1 μl，反应缓冲液10 μl，无菌水7 μl。反应条件为：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共33个循环，72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳（含0.5 mg/ml溴化乙锭）进行检测鉴定。阳性鉴定子通过测序PCR产物获得其基因序列。进化树分析采用在线生物分析工具进行。

3　结果

3.1BQCV基因扩增产物鉴定

BQCV基因PCR扩增产物经凝胶电泳分析，在700bp左右可见清晰特异性条带，大小与预期相符，如图1。

图1　BQCV电泳鉴定图（M：100bp DNA Marker；1：BQCV目标产物）

3.2BQCV进化树分析

利用系统进化树在线构建工具（http：//www. phylogeny.fr/simple_phylogeny.cgi？workflow_id=4010ce38 ce27ca7b88986ab861c50ea8&tab_index=6&go_next=1# anchor），采用最大相似然法，对已克隆并测序的BQCV辽宁株与来自NCBI数据库的其他已报道BQCV毒株构建进化树。结果显示，BQCV辽宁株与吉林株、韩国株在同一族，表明其进化关系最为相近，属于典型的亚洲型毒株。

图2　BQCV部分序列的进化树构建。黑点代表本研究扩增得到的BQCV部分序列

4　讨论

本检测首次报道了辽宁地区蜜蜂感染黑蜂王台病。虽然目前检测到BQCV存在于辽宁的大部分蜂群中，但并不代表之前未有感染。可能是由于之前的检测手段有限，也有可能是BQCV大部分处于隐性感染状态，而未被激活。本研究检测到了BQCV，并且可能是导致蜂群大量死亡的重要原因之一，但还不清楚什么原因导致BQCV的增殖或成为显性感染，原因仍需进一步探讨。

本研究不仅检测BQCV可能是影响辽宁地区蜜蜂健康新的威胁，而且也为BQCV的快速检测提供了可借鉴的方法。尤其是对于隐性感染的病毒性疾病诊断可快速、有效的鉴定，为有效控制辽宁地区病毒病的发生、传播提供指导。

［1］李明，马鸣潇，张轶博，等.辽宁地区中华蜜蜂囊状幼虫病的RT-PCR检测.畜牧兽医科技信息，2008，12：26-27.

［2］Bailey L，Woods RD.Three previously undescribed viruses from the honey bee.Journal of General Virology，1974，25：175-186.

［3］Benjeddou M，Leat N，Allsopp M，et al.Detection of acute of bee paralysis virus and black queen cell virus from honeybees by reverse transcriptase PCR.Appl Environ Microb，2001，5：2384-2387.

［4］Bailey L.The infection of the ventriculus of the adult honeybee by Nosema apis.Parasitology，1955，1：86-94.

［5］Allen M F，Ball B V.The incidence and world distribution of honey bee viruses.Bee world，1996，77：141-162.

［6］Kang Y B，Kim D S，Jang D H.Experimental studies on the pathogenicity and developmental stages of Nosema apis.Korean J Vet Res，1976，16：180-184.

［7］Ball B V，Allen M F.The prevalence of pathogens in honey bee（Apis mellifera）colonies infested with the parasitic mite Varroa Jacobsoni.Ann Appl Biol，1988，113：237-244.

［8］Leat N，Ball B，Govan V，Davison S.Analysis of the complete genome sequence of black queen-cell virus，a picorna-like virus of honey bees.J Gen Virol，2000，81：2111-2119.

［9］Li J L，Qin H R，Wu J，et al.The prevalence of parasite and pathogens in Asian honeybees Apis cerana in China.PLoS One，2012，11：e47955.

［10］Ai H X，Yan X，Han R C.Occurrence and prevalence of seven bee viruses in Apis mellifera and Apis cerana apiaries in China. Journal of Invertebrate Pathology，2012，109：160-164.

［11］Zhang X，He S Y，Evans J D，et al.New evidence that deformed wing virus and black queen cell virus are multi-host pathogens.Journal of Invertebrate Pathology，2012，109：156-159.

［12］杨倩，张健，宋战昀，等.蜜蜂黑蜂王台病研究进展.病毒学报，2015，3：318-325.

［13］杨倩，张健，宋战昀，等.黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株的分离鉴定及全基因组序列分析.病毒学报，2015，3：114-123.

［14］Chunsheng Hou，Hadassah Rivkin，Yossi Slabe，et al.Dynamics of the Presence of Israeli Acute Paralysis Virus in Honey Bee Colonies with Colony Collapse Disorder.Viruses，2014，6：2012-2027.

国家蜂产业技术体系专项经费（CARS-45-SYZ 3）

袁春颖（1981-），女，高级畜牧师，从事养蜂生产技术研究及推广工作，E-mail：chunying0914@163.com

刁青云，女，研究员，从事蜜蜂病害研究工作，E-mail：dqyun1@126.com