脊髓损伤生物标记物的研究进展

王玉明，唐丽，杨德刚，朱致敏

脊髓损伤生物标记物的研究进展

王玉明1，唐丽2，杨德刚1，朱致敏3

[摘要]脊髓损伤后各病理阶段均有各种蛋白表达，代表损伤和修复的病理变化。发现并筛选出理想的生物标志物，有助于进一步评估复杂的脊髓损伤生物反应并判断预后。目前，已有部分研究就神经元特异性烯醇化酶(NSE)、星形胶质原性钙结合蛋白S-100β作为脊髓损伤的血清学标志物进行了初步探索。但是，其特异性和敏感性仍需进一步明确。未来仍需开发能预测功能结果的理想生物标志物。

[关键词]脊髓损伤；生物标记物；综述

[本文著录格式]王玉明，唐丽，杨德刚，等.脊髓损伤生物标记物的研究进展[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(9): 1045-1048.

CITED AS: Wang YM, Tang L, Yang DG, et al. Advance in research of biomarkers of spinal cord injury (review) [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1045-1048.

创伤性脊髓损伤的预后存在诸多不确定性。不完全性脊髓损伤有多种结局，而完全性损伤也有少数可改善并转变为不完全性脊髓损伤。因此，准确评估脊髓损伤的程度对于指导治疗与判断预后显得尤为重要。

在目前的评估手段中，生物标记物日益受到重视。探讨外伤性脊髓损伤中生物标志物有着重要的临床和研究意义。理想的生物标志物应能评价神经组织损伤状况，并较准确地反映急性外伤性脊髓损伤的预后。

脊髓损伤引起多种生化级联反应，大多都反映在mRNA和蛋白水平的变化中，但仍不清楚基因参与这些过程的具体细节，不能明确哪种蛋白能成为标记物。在脊髓损伤研究中，生物标志物应具备辅助诊断和判断预后、指导治疗、结果评估和药物开发的特性[1]。

生物标志物用于监测脊髓损伤应满足以下验证标准[2]。①必要特性：生物标记物的变化能描述生物过程。与在疾病或恢复进展过程中临床变化相符合。②生物标记测量有明确目的，应适合盲法或集中评估；具有可重复性，重复测量可靠性高；特异地针对进展的变化；测量应该低信噪比；安全、可耐受，不应要求操纵控制。③成本相对便宜，容易使用。④纵向研究得到数据应该能用于足够数量的脊髓损伤个体，测量允许评价分布性质信息；允许计算样本的大小和权重，评估特定治疗对脊髓损伤的影响。

1　脊髓损伤后代表病理变化的蛋白表达变化

1.1细胞凋亡

第一阶段有半胱天冬酶、c-Jun、p53、Fas、FasL、CD95、Rho蛋白；第二阶段有半胱天冬酶、c-Jun、核因子-κB (nucle-ar factor-κB, NF-κB)、热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSP)。

1.2生长和分化

第一阶段有波形蛋白、转化生长因子β(transforming growth factor, TGF-β)、ania-6；第二阶段有波形蛋白、TGF、血管生长因子(vascular growth factor, VGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、酪氨酸激酶B (Tyrosinekinase, TrkB)；慢性阶段有波形蛋白、TrkB、骨形态发生蛋白。

1.3炎症反应

第一阶段有白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、IL-1β、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGF)、细胞因子信号抑制物(suppressor of cytokine signaling, SOCS)、单核细胞趋化蛋白(monocyte Chemoattractant protein-1, MCP-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、IL-4R、环氧酶-2(cyclo-oxygen-ase-2, COX-2)、IL-2Rα、HSP；第二阶段有IL-6、IL-1、IGF、SOC、MCP-1(IESR-JE)、ICAM-1、iNOS、GFAP、肿瘤坏死因子受体、COX-3(-)、HSP27；慢性阶段有IL-6、IL-1β、IGF、HSP2。

1.4离子转运的调控

第一阶段有Ca2+-ATP酶(-)(“-”表示表达下调。下同)；第二阶段有Ca2+-ATP酶(-)、K+通道、Na+通道(-)、Na+/K+-ATP酶(-)；慢性阶段有Ca2+-ATP酶(-)。

1.5神经保护

第一阶段无；第二阶段有金属硫蛋白Ⅰ和Ⅱ、生存的运动神经元；慢性阶段有金属硫蛋白Ⅰ和Ⅱ。

1.6神经元之间的信息交流

第一阶段有突触相关蛋白-25 (synapse-associated proteins-25, SNAP25)(-)、syntaxins(-)、谷氨酸受体；第二阶段有SNAP25(-)、syntaxins(-)、突触蛋白(-)、生长抑素(-)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)转运体(-)、谷氨酸受体、GABA受体(-)、谷氨酸转运体；慢性阶段有GABA受体。

1.7神经元和神经胶质细胞的修复和再生

第一阶段有巢蛋白、两面神激酶(Janus kinase, JAK)、信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)、c-Fos；第二阶段有巢蛋白、波形蛋白、发动蛋白(-)、c-Fos；慢性阶段有semaphorin、生长停滞特异性基因-7(growth arrest specific proteins -7, GAS-7)、epithelins 1和2、血小板因子4。

1.8传递外部信息到细胞核中的蛋白质

第一阶段有磷酸二酯酶(phosphodiestera, PDE)、CaM激酶(-)；第二阶段有PDE、有丝分裂活化蛋白(mitogen-activated protein, MAP)激酶、CaM激酶(-)。

1.9产生和维持细胞结构的蛋白质

第一阶段无特异蛋白；第二阶段有髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)(-)、神经丝蛋白、溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP1) (-)、微管相关蛋2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)、tau蛋白(-)。

1.10DNA合成的调节

第一阶段有Fra-1、神经生长因子诱导A基因(nerve growth factor induced Agene, NGFI-A)；第二阶段有Fra-1、NGFI-A。

蛋白质和DNA基因芯片的研究分析可准确反映脊髓损伤变化[1]。

2　脊髓损伤生物标志物的研究现状

MRI不能区分组织破坏和水肿的进程，神经电生理监测也很少能应用于急性期脊髓损伤患者[3]。因此，血清测试可能为脊髓损伤后持续的组织破坏提供定量评估，协助临床决策。

直接从脊髓组织获得mRNA或蛋白质样品非常困难，并且可能会引起并发症。mRNA和蛋白的最实际来源是血清和脑脊液。穿刺获得脑脊液是侵入性程序。尽管抽取血液样本容易收集血清，但是由于血液样本中存在多种蛋白质，如白蛋白、免疫球蛋白G和转铁蛋白(占血清总蛋白约80%)，将导致分析复杂化。这些背景蛋白质水平较高，难以筛选出低浓度水平变化的蛋白质，样本有效性难以保证。来自神经元和神经胶质细胞的mRNA表达不够丰富，并迅速降解；同时，由于血清和脑脊液是脊髓mRNA和蛋白的间接来源，并没有很好地体现与脊髓损伤有关联基因的整体数量。此外，表达的蛋白质通常仅限于那些在细胞表面和细胞内的小浓度mRNA以及细胞死亡时释放的蛋白质，进一步限制了生物标志物分析[1]。

成像技术、生物标记结合分子遗传技术，通过界定细胞活动和功能改变的特异性分子，监控损伤和恢复的进程，可为研究人员提供功能强大的工具。快速、操作简单、低成本、经论证有效、对中枢神经损伤进行确诊及定量评估的血液检测将非常有价值。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、星形胶质原性钙结合蛋白S-100β作为中枢神经损伤的特异标志物，目前在脑损伤疾病的血清测量方面有大量研究[4-11]，借鉴其经验，脊髓损伤领域已有初步研究，但临床文献较少[12-13]。

2.1NSE、S-100β的生物学特性

烯醇化酶有5种异构酶，分别由免疫性质不同的3种亚基α、β、γ组成，即αα、ββ、γγ、αβ、αγ，均为胞浆二聚体酶。烯醇化酶普遍存在于生物体内的糖酵解代谢中，它催化α磷酸甘油转化为磷酸烯醇式丙酮酸。免疫组化研究表明，烯醇化酶同工酶均存在于细胞浆中，γγ型特异性地存在于神经元和神经内分泌细胞中，故名为NSE，是目前唯一能特异性反映神经元损伤的生化标志物，体内分布部位由高到低依次为脑、脊髓和周围神经节，脑内NSE水平超过周围神经节的10～100倍。正常血液中NSE含量极微，约3～8 ng/ml[1]。

当损伤因素影响神经元的代谢、神经元细胞膜功能与结构时，NSE从胞质释放到细胞间隙和脑脊液中，穿过破损的血-脑屏障进入血液循环，使血清中NSE含量升高。其含量可反映神经元受损的程度，对早期直接而准确地了解中枢神经损伤程度具有重要的临床意义[13]。

S-100β蛋白是一组可完全溶于中性饱和硫酸铵溶液中的酸性钙结合蛋白，由α、β两个亚基组成。中枢神经系统表达的主要是S-100ββ(又称S-100β)，在人体主要集中于中枢神经系统的星形胶质细胞、少突胶质细胞和周围神经系统的施万细胞。其主要生物学功能包括：①调节细胞间交流和细胞内的信号传递等过程；②生理浓度的S-100β具有神经营养作用；③促进轴突生长、胶质细胞增生、神经元分化和Ca2+内环境的稳定等。

正常情况下，S-100β血清含量<0.12 μg/L。血清S-100β达0.15～0.5 μg/L为临界值，>0.5 μg/L为病理性升高。S-100β水平可反映胶质细胞损伤程度。胶质细胞损伤后，星形胶质细胞大量释放S-100β，刺激星形胶质细胞和小胶质细胞等产生大量致炎性因子和一氧化氮(nitric oxide, NO)，导致神经元功能障碍或死亡[14-17]。

2.2NSE、S-100β与脊髓损伤的关系

脊髓损伤后的病理生理改变和预后是研究关注的重要问题。外伤性脊髓损伤患者常在最初创伤急性期后出现运动和感觉功能障碍。脊髓损伤急性期后的病理过程，包括缺血、细胞内钙增加、自由基和脂质过氧化生成、兴奋性氨基酸产生及炎症过程，均由不同因素介导。但是，目前外伤性脊髓损伤急性期的神经生理活动细节尚未阐明，反映脊髓神经损伤病理改变进而预测结果的生物标记物尚待研究。

NSE、S-100β在脑损伤及脑疾病领域的相关研究可为其在脊髓损伤中的变化规律及其在神经病理生理中的意义提供借鉴。众多研究结果提示，S-100β涉及胶质和神经细胞损伤病理机制和重塑机制，是神经细胞完整性的生物标志物，与治疗和预后相关。

S-100β在损伤时由于胶质破坏而升高，在严重损伤时持续升高，反映了急性期蛋白反应。由于其分子量小，易透过血脑屏障，所以血清浓度能反应脑脊液水平，并且比脑脊液水平更能反映神经的代谢。S-100β还与脊髓损伤后疼痛和痉挛的调制有关，通过测定S-100β浓度可以反映一部分实质变化[18]。

目前对脊髓损伤后蛋白作为生物标记物的变化能否准确反应神经损伤病理变化及指示预后仍在继续研究中。

研究急性脊髓损伤模型发现，S-100β、NSE蛋白水平显著升高[19]。Loy使用动物脊髓挫伤模型，发再血清NSE和S-100β蛋白在急性脊髓损伤后6 h增加，随后24 h内减少。研究表明，早期血清NSE升高与脊髓损伤后数小时内在原发部位发生神经元死亡的一个波峰相关。S-100β蛋白定位在星形胶质细胞，因此可以被认为是脊髓损伤后白质异常的一个主要标记[13]。王华等报道血清NSE与患者脊髓损伤程度成正相关[20]。动态观察表明，不同时段的血清NSE与脊髓损伤程度的相关性不同。伤后第3天血清NSE与脊髓损伤程度相关性最高，第1天最低，表明伤后第3天测定血清NSE浓度最能反映脊髓损伤程度。将NSE与影像学方法进行比较发现，伤后第2、3天血清NSE水平较影像学方法更能反映脊髓损伤程度[20]。另有报道，血清S-100β水平可以用来判断预后，但NSE却不能[21]。血清NSE与脊髓损伤程度具有相关性这一初步结论能否经受大样本检验，颈髓、胸髓、腰髓和神经根损伤NSE表达是否会有区别，这些问题都有待于进一步探讨。

NSE和S-100β蛋白可能是评估组织损失和预测急性脊髓损伤功能预后的实验工具，但仍未明确[14]。NSE、S-100β在脊髓损伤领域的初步研究结果显示，这两种蛋白缺乏作为脊髓损伤生物标记物应具有的特异性和敏感性，暂不能可靠地测量急性期脊髓损伤后的二次生理变化机理，也不能预测脊髓损伤患者预后并发展有针对性的治疗对策。因此，脊髓损伤后蛋白能否作为生物标记物准确反应神经损伤病理变化及指示预后仍需进一步研究。

创伤性脊髓损伤的生物检测通常受酒精、药物中毒、严重全身损伤、极早期医疗检查等多因素影响。在检测过程中，应该仔细考虑与临床应用相关的潜在问题，例如，多发伤、溶血、复苏状况不佳等情况，尽可能人为地提高这些标志物水平[22]。同时，必须注意控制这些临床变量确保准确的结果和防止错误结论。

理论上，血清标志物在一定程度上有助于评价组织损伤程度、神经功能状态及急性外伤性脊髓损伤预后。因此，即使存在以上问题，我们也应积极探讨外伤性脊髓损伤中血清标志物的试验及临床意义。通过研究特定脊髓损伤动物模型及临床急性脊髓损伤患者中NSE、S-100β随时间的变化情况，填补实验数据空白，为未来的相关研究奠定基础。

轴突特异性蛋白作为继发性轴索损伤和再生的标记，最有可能通过基因芯片或蛋白质组学方法鉴定[23-27]。这些轴突特异性标志物可能揭示继发性轴索损伤机制以及再生机制[28]。

3　脊髓损伤生物标志物的前景或展望

到目前为止，脊髓损伤长期预后的最好指标仍然是伤后最初几天的临床恢复程度。目前，没有生物标记物能明显显示活体脊髓细胞发生的变化，如轴突生长、细胞死亡或基因表达等。未来研究应该集中在轴突特异性蛋白，并最有可能通过基因芯片或蛋白质组学方法努力发现能准确地在脊髓损伤急性期预测功能结果的生物标志物，作为继发性轴索损伤和再生的标记。

脊髓损伤领域的研究者应借鉴多发性硬化、阿尔茨海默病、癌症生物学等其他领域的研究方法。目前重点推进的蛋白质组阵列和临床生物标志物识别研究，可为脊髓损伤的研究提供帮助。希望在不久的将来，脊髓损伤后生物标志物能用于患者个体的临床诊断或预测。

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·综述·

作者单位：1.中国康复研究中心北京博爱医院脊柱脊髓功能重建科，北京市100068；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068；3.广东省廉江市人民医院，广东廉江市524400。作者简介：王玉明(1965-)，男，汉族，内蒙古包头市人，硕士，副主任医师，主要研究方向：骨科和脊柱脊髓损伤。

Advance in Research of Biomarkers of Spinal Cord Injury (review)

WANG Yu-ming1, TANG Li2, YANG De-gang1, ZHU Zhi-min3
1. Department of Spinal and Neural Function Reconstruction, Beijing Bo'ai Hospital, China Rehabilitation Research Center, Beijing 100068, China; 2. Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine, Beijing 100068, China; 3. The Lianjiang People's Hospital, Lianjiang, Guangdong 524400, China

Abstract:Various functional proteins are differently expressed in each pathologic stage after spinal cord injury, representing injury and the pathological change of repair. Ideal biomarker is helpful to evaluate complicated biological reactions of spinal cord injury and predict prognosis. As specific serum markers of central nerve injury, neuron-specific enolase (NSE) and astrocyte primary calcium binding protein S-100β had been studied preliminarily, but the specificity and sensitivity need more research. Future efforts still need to develop ideal biomarkers to predict functional outcome.

Key words:spinal cord injury; biomarker; review

(收稿日期：2014-07-25修回日期：2014-09-19)

基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(No. 2012CZ-35)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.013

[中图分类号]R651.2

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)09-1045-04