反刍动物瘤胃甲烷产生的营养调控

王胤晨，袁 扬，张锦华，何光中，韩 勇，周文章

（1.贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳550000；2.西南大学荣昌校区，荣昌462460）

全球大气中最主要的温室气体有CO2、CH4、N2O。近几个世纪以来，随着工业、农业的不断发展，温室气体浓度都显著的提高。CH4是大气中重要的微量有机温室气体。当前CH4是人类生活中产生的仅次于CO2的第二大温室气体。CH4对气候变暖的影响是所有影响全球气候变暖因素的15%～20%，其增温潜势是CO2的62倍。2005年大气中CH4的浓度为1774ppb，比1998年增加11 ppb，每年大约有5～5.5亿吨CH4进入大气，远远超过大气反应和土壤微生物可以利用消耗的总和［1］。其中，反刍动物年产CH4约7.7×107t，占大气中的CH4总量的25%，而且每年还以1%的速度递增［2］。反刍动物CH4气体的排放不仅造成环境污染，而且引起能量的损失。随着各国对温室气体排放的重视，调控反刍动物瘤胃功能减少CH4排放，使更多的能量和碳源转化为可供动物利用的挥发性脂肪酸，降低瘤胃发酵的能量损失，提高饲料利用率，这对缓解全球气候变暖具有重要的现实意义。

1 瘤胃甲烷的形成

瘤胃微生物发酵中，产甲烷菌利用瘤胃细菌、真菌、原虫降解底物所产生的物质生成甲烷，其中瘤胃甲烷主要来自于瘤胃中的H2和CO2的反应。Thauer等研究报道产甲烷菌是目前已知的唯一一类以甲烷为代谢终产物的微生物，是产甲烷菌获得能量的唯一途径［3］。瘤胃内 H2分压过高时，瘤胃有益菌的活性和生长受到抑制，产甲烷菌的存在能消耗H2，保持瘤胃内低水平的H2分压，这对维持瘤胃微生态的平衡具有重要意义。

现有的研究表明甲烷的生物合成机制有四种途径［4］：第一，CO2－H2还原合成甲烷；第二，甲酸氧化途径；第三，乙酸异化途径；第四，甲醇不成比例的分化途径。其中，瘤胃甲烷的合成大部分来自第一种途径，占瘤胃甲烷总产量的82%，其它三种途径产甲烷量较少，占瘤胃甲烷总产量的18%。

虽然甲烷只能由产甲烷菌合成，但瘤胃甲烷的产量与甲烷菌数量却没有一定的比例关系，瘤胃产甲烷菌与其他微生物在代谢上紧密关联，甚至附着于其他微生物［5］。瘤胃中许多产甲烷菌附着于瘤胃原虫上，利用其发酵产物H2生成甲烷；瘤胃厌氧真菌能降解植物纤维产生乙酸、甲酸、H2、CO2、乳酸和少量乙醇，其中大部分产物都能被产甲烷菌利用；瘤胃纤维降解细菌和产甲烷菌共培养时，能提高纤维降解率和甲烷产量。综上所述，瘤胃内甲烷的合成是依靠产甲烷菌和其他微生物之间的复杂关系相互作用形成的，是一个极为复杂的过程。

2 产甲烷菌与瘤胃微生物之间的关系

反刍动物的瘤胃内栖息着各种复杂、多样、非致病的微生物，包括瘤胃细菌、厌氧真菌、原虫和古菌，还有少数噬菌体。瘤胃微生物之间处在一种相互制约、相互依赖的动态平衡中。瘤胃微生物种群多样、关系复杂，但是都可以分为产氢和耗氢微生物两大类。产氢微生物主要有瘤胃纤维降解菌、厌氧真菌和原虫；耗氢微生物在瘤胃内的主要代表是产甲烷菌，能利用H2进行代谢生长，产生CH4。瘤胃中如果H2累积，还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸（DADH）的氧化作用受到抑制，乳酸等还原性发酵产物积累，进而阻碍粗饲料的消化和有益微生物的生长繁殖。产甲烷菌被抑制后，会出现H2的积累［6］。如何保证CH4产量减少的同时，H2不会累积，是调控甲烷生成时需考虑的重要因素。

2.1 产甲烷菌与纤维降解菌

反刍动物瘤胃纤维降解菌在降解日粮中的纤维素和半纤维素时会产生大量的H2，这些H2被产甲烷菌利用，同时降低了还原性核苷酸的累积，提高纤维降解菌的能量利用率和纤维消化率。有研究发现，许多反刍动物的纤维降解菌的数量和甲烷菌的数量呈正相关关系，这说明纤维降解菌和产甲烷菌之间因为种间氢传递而存在着某种相互促进的共生关系［7］。Wolin等通过白色瘤胃球菌纯培养和与产甲烷菌共培养的研究发现，白色瘤胃球菌纯培养时产生乙醇、乙酸、H2和CO2，有少量的甲酸，但是共培养时不产生乙醇，并且乙酸的含量增加［8］。纤维降解菌与产甲烷菌单独培养时，通过NADH的重新氧化降低瘤胃氢分压；而当他们共同培养时，在一些酶的催化作用下，NADH氧化产生H2，用于甲烷的合成。通过这一系列反应，使氢分压降低，氢的总产量和乙酸的产量增加，同时两种微生物的ATP产量增加、纤维素酶产量增加，而纤维素分解加快。黄色瘤胃球菌与产甲烷菌共培养时，琥珀酸含量降低，而乙酸产量大大提高［9］。但并不是所有的纤维降解菌降解植物纤维时都会产生H2，因此提高此类纤维降解菌在瘤胃细菌中的比例，在不影响粗饲料消化的前提下，可以对其进行深入研究。

2.2 产甲烷菌与厌氧真菌

瘤胃厌氧真菌降解粗纤维后，主要产物有甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H2和CO2。产甲烷菌与瘤胃厌氧真菌存在种间氢转移作用，他能提高厌氧真菌纤维素酶与半纤维素酶等的酶活，促进厌氧真菌对纤维和半纤维素的降解［10］。真菌与产甲烷菌体外共同培养研究发现，发酵转向乙酸型，乳酸和乙醇的产量减少，而H2和甲酸却非常少，但是乙酸的浓度取决于共培养时产甲烷菌的种类，同时各种纤维降解酶的活性显著提高，纤维降解率显著增加［11］。更早的研究表明，瘤胃真菌和产甲烷菌共同培养能明显地提高植物纤维降解酶的活性，并认为产甲烷菌促进了分解纤维真菌的活性，改变发酵产物，产生更多的乙酸、CH4和CO2［12］。在瘤胃中共培养效应可能起很大的作用，甲酸、乳酸、和乙醇能够抑制厌氧真菌的纤维素降解，乳酸大量积累往往会影响原虫的代谢，而引起酸中毒，共培养时，由于甲酸和乳酸被产甲烷菌利用生成乙酸和CH4，从而使附着在底物上的真菌数也相应增多，对底物的降解率相应增高。因此，共培养避免了这些发酵产物可能引起的副作用。尽管在瘤胃中可能有更复杂的关系，但是怎样在厌氧真菌降解纤维素和CH4产量上找到一个平衡，在提高纤维降解率的同时降低CH4产量。对于真菌降解纤维素的效率和CH4产量的关系，还有待进一步研究。

2.3 产甲烷菌与原虫

产甲烷菌和瘤胃原虫之间是兼性共生关系，它们的结合方式主要有两种：内共生和外共生。瘤胃原虫的细胞膜内壁结合有多重脱氢酶，能催化底物脱氢，产生的氢分子则附着在原虫上，然而氢分子会抑制原虫的增殖，但寄生的产甲烷菌能利用这些氢分子合成CH4。其中，瘤胃10%～20%的产甲烷菌附着在纤毛虫表面，寄生在原虫胞液里面的产甲烷菌比表面上的产甲烷菌数量要多得多。并且有学者研究报道，并不是所有的瘤胃纤毛虫表面都有附着产甲烷菌［13］，因此推测细胞外黏附甲烷菌在瘤胃纤毛虫的产CH4过程中并不是特别重要，而内共生产甲烷菌则可能起着关键的作用。但两者在功能上是否一样尚无定论。

迄今为止，有关纤毛虫对CH4合成的作用仍存在争议，部分学者认为纤毛虫可促进瘤胃CH4的合成。Newbold等报道，产甲烷菌与原虫共生而产生的CH4量占瘤胃总CH4产量的9%～25%［14］。Schonhsen等通过把出生不久的小牛随机分成两组，一组使其含虫，另一组不含虫，体外培养结果表明，含虫组的CH4产量比不含虫组高34%；在动物体内试验时，含虫组的CH4产量比不含虫组高30%，结果说明纤毛虫对瘤胃CH4的合成有一定的作用［15］。Dohme等体外连续培养试验表明，去原虫可以显著降低CH4产量，但甲烷菌数量不变，说明去原虫引起的CH4产量降低可能与甲烷菌活力的变化有关［16］。以上各位学者研究表明，去原虫可能是瘤胃降低CH4产量，提高生产性能的一种途径。人们也在不断寻找去原虫技术，但现在还没有能应用到实际生产当中的，可能是去原虫技术对动物本身或瘤胃内其他微生物有害。

但另有研究表明，纤毛虫对瘤胃CH4的作用不明显。Krumhliz等通过将3只刚出生的绵羊与其他羊进行隔离饲养到成年，使其不含纤毛虫，然后接种纤毛虫，分别测定接种前后瘤胃液产CH4活力，发现其活力差距不明显，分别为每毫升每分钟产16.8nmol和16.3nmolMachmuller等体内试验发现，去原虫不能减少CH4产量，他们认为瘤胃液中纤毛虫和产甲烷菌数量的减少并不意味着有效地降低了瘤胃的CH4产量，通过降低产甲烷菌活力及改变瘤胃产甲烷菌组成等途径可能会降低CH4产量［18］。

3 瘤胃内甲烷的营养调控

3.1 卤代物及其衍生物

卤化物及其类似化合物是反刍动物体内CH4生成的有效抑制剂，如三氯乙烷、三氯乙炔、溴氯甲烷等，均对产甲烷菌有毒害抑制作用，可抑制20%～80%的CH4产生。水合氯醛在瘤胃中转化成氯仿，氯仿可以降低CH4的生成，但是水合氯醛损坏肝脏、长期饲喂会引起动物中毒，甚至死亡，所以不运用于实际生产中。另外卤化物抑制CH4排放的效果非常短暂。各种产甲烷菌对卤化物的敏感性各不相同，2－溴乙烷磺酸钠（BES）抑制CH4生成的效果较明显，但在动物实验发现其抑制效果短暂，可能是产甲烷菌对BES产生了适应性［19］。

3.2 微生物调控

3.2.1 去原虫 原虫在瘤胃纤维发酵中发挥重要的作用，瘤胃中50%左右的纤维降解活性来自原虫。大量研究表明有10%～20%的产甲烷菌寄生在原虫表面，其CH4产量占到瘤胃液总CH4产量的9%～25%、甚至37%。因此去除原虫可间接减少甲烷菌数量，进而降低反刍动物的CH4排放。

添加含饱和脂肪酸的保护性脂肪可减少排放，亚麻油和椰子油是目前研究较多的去原虫植物油。张春梅等体外培养试验发现，添加亚麻油能显著降低CH4的产量，并且可以使瘤胃发酵模式向丙酸类型转变［20］。McGinn等研究表明，肉牛日粮中添加400g／d的葵花籽油可使排放减少22%，总能的损失减少了21%［21］。Mao等试验表明，添加大豆油使湖羊CH4产量降低13.9%，产甲烷菌数量显著降低，原虫数量略有下降［22］。Hu等通过体外培养实验发现，茶皂素对原虫具有抑制作用，其中添加0.4mg／ml茶皂素处理组的原虫数比对照组减少16.39%，CH4产量下降15.79%，微生物蛋白比对照组增加12.12%，改善瘤胃发酵的作用［23］。

3.2.2 增加乙酸生成菌 乙酸菌是存在于瘤胃内的耗氢菌之一，可同产甲烷菌竞争H2，改变H2和CO2的利用方式，生成乙酸。因此，提高乙酸菌对H2的利用是减少CH4生成的另一种方式。但是在瘤胃内产甲烷菌与乙酸菌共存时，产甲烷菌对H2的利用处于竞争优势地位，主要原因是只有较高的氢阈值才能满足乙酸生成需要。体外培养试验发现瘤胃液中添加乙酸菌时，CH4产量降低［24］。增加乙酸菌在瘤胃内的数量是调控瘤胃发酵的可行途径，但由于人类分离得到的乙酸菌数量有限，还需进一步研究影响乙酸菌活性的因素和提高瘤胃内乙酸产量的方法。目前有效的方法是研究出高H2亲和性的特异乙酸菌，可在瘤胃内与产甲烷菌有效竞争，或在产甲烷菌受抑制的条件下添加乙酸生成菌，从而降低 CH4产量［25］。

3.2.3 甲烷氧化菌 甲烷氧化菌（Brevicillus parabrevis）以甲烷为唯一的碳源和能源，瘤胃内积聚的CH4是由CH4生成和氧化之差形成的。学者们已从瘤胃中分离到甲烷氧化菌，但目前有关瘤胃甲烷氧化菌对CH4抑制效果的报道非常少。Nelson等试验表明甲烷氧化菌作为益生素应用于体内和体外试验中，分别使 CH4产量减少5.9%和18.2%［26］。Kajikawa等研究发现，氧气、溴乙烷磺酸盐和钼酸盐可以抑制CH4氧化，瘤胃内的CH4氧化反应严格厌氧，并且与硫酸盐的还原反应偶联［27］。提高CH4在瘤胃内的氧化，可能是降低CH4产量的另一种途径，但其在瘤胃内的重要性、体内的应用效果、日粮的影响及应用的加量效应还需进一步研究。

3.3 饲料添加剂的调控

3.3.1 离子载体 离子载体是一类土壤微生物产生的聚醚类抗生素，离子载体降低CH4的产量机理可能是改变发酵类型，由乙酸型发酵转变成丙酸型发酵，或通过抑制H2的产生而降低CH4的产量。莫能菌素是广泛应用于调节瘤胃发酵的离子载体。Van Nevel等研究表明，莫能菌素能降低动物体内25%的CH4产量［28］。Gaun等研究发现莫能菌素应用于肉牛时，饲喂低纤维饲料的牛CH4产量减少27%，而饲喂高纤维饲料的牛CH4产量减少30%［29］。但是莫能菌素对CH4生成的抑制效果不持久，连续使用效果不佳。并且由于离子载体是一类抗生素，在畜产品中残留对人体健康造成严重威胁，越来越多的消费者反对其在日粮中的使用。

3.3.2 电子受体 甲醇和其他醇类及乙酸，都能作为电子供体合成甲烷，减少产甲烷菌对H2的利用，转移H2可减少CH4的产量。富马酸、苹果酸、延胡索酸等二羧酸作为丙酸合成的前体物，可充当H2的受体与产甲烷菌竞争H2，生成丙酸，从而减少生成CH4的H2。Asanuma等体外试验研究表明添加富马酸和延胡索酸能增加丙酸的产量，减少CH4的产量［30］。Bayaru等报道，饲粮中添加2%延胡索酸，单位进食量的CH4排放量降低22%［31］。Li等通过体外培养试验发现在含有亚麻油的底物中添加苹果酸和延胡索酸不但能降低CH4产量，而且cis9、trans11－共轭亚油酸的浓度明显升高［32］。虽然二羧酸能有效改变H2的利用途径，同时生成丙酸而降低CH4产量，但反刍动物二羧酸的添加会导致瘤胃pH降低，并且饲粮也影响动物的适口性。为了防止瘤胃发酵受到影响可以添加这些酸的钠盐，或制备成胶囊［33］。富马酸二钠盐可以有效维持瘤胃pH值，同时促进瘤胃体外发酵和山羊体内发酵［34］。Wallace等利用包被的富马酸产品降低CH4产量而不影响瘤胃发酵，体外培养时，包被在氢化植物油中的富马酸能抑制CH4的生成，同时不影响瘤胃pH值。体内试验进一步证实包被的富马酸能降低CH4产量，提高动物生产性能、增加活体增重及饲料转化率［35］。

3.3.3 植物提取物 关于植物的提取物调控反刍动物瘤胃发酵及降低CH4排放是目前广大学者研究的热点。大量体内试验和体外试验表明植物提取物会影响瘤胃CH4的生成。

反刍动物日粮中添加未皂化的脂肪能间接或直接的抑制CH4生成，间接作用包括降低不饱和脂肪酸双键、降低饲料摄入量、抑制原虫及增加丙酸产量；直接作用及脂肪酸对产甲烷菌的抑制作用。Mcginn等研究发现牛日粮中添加向日葵油能降低乙酸浓度提高丙酸浓度，降低乙酸与丙酸的比例［21］。并且油脂对瘤胃CH4生成的抑制作用与饲料组成有关，Machmueller研究发现，与粗料相比，在精料中添加椰子油对CH4排放的抑制效果更好［36］。植物提取物包括皂角苷、单宁、精油等对瘤胃CH4产生有显著的抑制作用［37］。皂苷主要通过对原虫的抑制作用来调控反刍动物CH4的产量。单宁对产甲烷菌具有抑制作用及对瘤胃纤维降解具有促进作用，故富含缩合单宁的植物能降低绵羊和牛瘤胃CH4生成，日粮中添加缩合单宁能减少山羊CH4的排放［38］。Hu等体外培养使用高剂量的茶皂苷使原虫数量下降79%，CH4产量下降26%［23］。

一直以来，科研工作者们一直在不断的探索寻找能有效降低瘤胃CH4生成的方法。到目前为止，已有较大的研究进展，根据CH4的合成机理，发现通过很多途径能抑制并降低CH4的排放，但同时很多研究结果也多少存在局限性，因而无法应用到实际生产当中。如甲烷卤化物可以直接抑制CH4生成，但是由于其生物安全性差或抑制时间较短，不适合在生产实际中使用；乙酸生成菌能与产甲烷菌竞争氢离子，使CH4产量降低，但是由于学者们分离得到的乙酸生成菌数量和对其认识有限等原因，此方法也无法用于实际操作；去除原虫可以降低CH4产量，通过减少与原虫共生的产甲烷菌数量来实现，但目前的去原虫技术，常常存在对其他瘤胃微生物或动物本身有害，至今还没有一种能应用于实际生产的去原虫技术；离子载体型抗生素也能降低CH4的合成，但因其在体内残留问题，在生产当中也遭到质疑。因此，需要对产甲烷菌和其他微生物的关系以及CH4的合成机理更加深入的研究了解，利用瘤胃基因组技术和新的“组学”技术，不断地开发研究降低瘤胃CH4排放的新方法。

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