鸭H5亚型高致病性禽流感疫苗研究进展及其效率影响因素

蒋文明，陈继明

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

鸭H5亚型高致病性禽流感疫苗研究进展及其效率影响因素

蒋文明，陈继明

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

鸭在H5亚型高致病性禽流感的流行中发挥重要作用，成功控制鸭H5亚型高致病性禽流感对根除该病在家禽中的流行和人类健康具有重要的意义。本文对当前鸭H5亚型高致病性禽流感疫苗使用和研究进展，以及影响疫苗效率的因素（疫苗类型、鸭的品种、免疫程序、疫苗的抗原匹配性、佐剂、免疫覆盖率）进行了综述。

鸭；高致病性禽流感；H5；免疫接种

水禽是禽流感病毒（Avian influenza Virus，AI）的主要天然储存库。大多数的禽流感病毒可以通过自然或试验感染鸭，包括高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV），然而，目前关于鸭对AIV感染后免疫反应的知识仍十分有限。H5 HPAIV对鸭致病性的差异会直接影响到对该病的监测和控制，因为人们很难识别那些无症状或轻微症状的感染鸭，导致病毒传播到其它易感家禽，并可能威胁到人类健康。

考虑到H5 HPAIV在世界某些地区的水禽中广泛存在，因此，为控制H5 HPAIV的传播，降低鸭感染病毒的风险至关重要。在有效控制H5 HPAI措施中，除了生物安全措施，免疫接种是一个可以帮助控制H5 HPAI的有力工具。

1　鸭H5 HPAI疫苗研究进展

临床上，鸭使用的大多数疫苗是用自然分离的或反向遗传产生的低致病性禽流感病毒制备的油乳剂灭活疫苗。在预防和控制家禽H5 HPAI方面，传统的灭活疫苗是有效的。然而，疫情仍然在家鸭中不断发生。2014年以来，英国、韩国、日本、美国、中国等多个国家相继发生鸭H5亚型禽流感疫情。免疫接种的一个新途径是使用新型病毒载体疫苗，如痘病毒载体，它在北京鸭和番鸭上表现出良好的免疫原性，而且还可以进行1日龄接种［1］。

除了痘病毒疫苗，新型疫苗如鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）或新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）载体疫苗，也在鸭上进行了评估试验。Liu等［2］将H5N1病毒的HA基因插入DEV基因组中，构建了重组病毒。鸭免疫攻毒试验表明，重组体与DEV活疫苗有类似的保护效果，单一剂量免疫3天后就可以诱导针对致死DEV攻毒和致死H5N1 HPAIV攻毒的完全保护。结果表明，重组DEV适用于双价弱毒活疫苗，可以快速和完全保护鸭免受DEV和H5N1 HPAIV的攻击。

2006年以来，我国开发了表达H5N1禽流感病毒HA基因的重组鸡NDV，制作NDV和H5N1病毒的双价疫苗［3］。Ferreira等［4］的一项研究表明，重组NDV疫苗可以诱导11日龄的骡鸭产生体液和细胞免疫反应，H5N1 HPAI攻毒后可以获得完全的临床保护。但是，也发现母源抗体会抑制机体对疫苗的免疫反应。

1.2标记疫苗

为区分免疫鸭与感染鸭，应当考虑在血清学监测中使用DIVA（Differentiation of Infected from Vaccinated Animals）策略。一种方法是在疫苗中加入外源抗原，用作免疫接种的阳性标记，如使用破伤风类毒素（TT）标记的H6N2禽流感疫苗［5］。两次免疫后，可以产生高滴度的TT特异性抗体，并可以维持19个周。灭活H6N2疫苗插入TT后，没有干扰H6或TT的血清阳转，表明TT可能是一个高度适合的鸭禽流感疫苗的外源标记。基于表达H5 HA抗原的重组杆状病毒亚单位禽流感病毒疫苗和带有标记抗原（TT）的灭活H5N2禽流感疫苗，可以保护幼鸭。

2　影响鸭疫苗效率的因素

影响鸭H5 HPAIV疫苗效率的因素很多，包括疫苗类型、鸭的品种、免疫接种程序（接种日龄、接种剂量、有效HA抗原量）、攻毒病毒以及实验环境等。针对这些因素的研究和提高对H5 HPAI的控制有着重要意义。在大多数情况下，接种疫苗的鸭子可以获得保护和减少排毒。如果疫苗与流行毒的抗原性匹配良好，免疫方法正确，免疫禽群的排毒量会大大降低，不足以感染接种或未接种疫苗的禽类。

2.1疫苗类型

临床上，家鸭使用的大多数疫苗是油乳剂灭活疫苗。由反向遗传生产的灭活疫苗Re-1，含有A/ goose/Guangdong/1/96 （H5N1）的NA基因和修饰的HA基因，能够保护鸭不出现临床症状，并减少排毒。Re-1疫苗诱导北京幼鸭和番鸭产生低水平到中等水平的抗体滴度，免疫2周后攻毒可以保护它们不发病，但不能阻止排毒。研究结果表明，单一疫苗接种剂量不足以减少H5N1 HPAIV的传播，因此，加强免疫接种是必需的。Van der Goot等［6］的一项研究也证明鸭接种两次全病毒灭活疫苗可以获得更好的保护。

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2.2鸭的品种

北京鸭是H5N1 HPAI疫苗效率评估研究中使用较多的实验动物，其它如美洲家鸭、麻鸭、骡鸭、绿头鸭则相对较少。不同品种的鸭对免疫接种的应答不同，因此试验条件不相同时很难对结果进行比较。使用禽痘病毒载体疫苗研究显示，北京鸭和番鸭对疫苗接种存在差异。免疫番鸭的排毒期可长达19天，而北京鸭在任何时间点都没有检测到排毒。

当感染H5N1 HPAIV时，番鸭比其他品种的鸭，如北京鸭、绿头鸭、康贝尔鸭等表现出更严重的临床症状，骡鸭似乎也比番鸭更耐受H5N1病毒感染，表明它们在先天性免疫应答和适应性免疫应答方面存在差异。因此，在实践中应当考虑不同种类的鸭子对H5N1 HPAIV的致病性不同和对免疫接种的应答差异。不管灭活疫苗还是活疫苗，都应当特别关注番鸭，可能需要更多的加强免疫才能获得与其他鸭子相同水平的保护。

2.3免疫接种程序

为了探索更有效的接种方法，研究者在北京鸭和番鸭上分别试验了三种不同的免疫程序，前两种方法是在1天和14天或7天和21天接种两个剂量的疫苗，第三个程序是在14天时接种一个剂量的疫苗。结果发现7天和21天时接种能获得最好的保护［7］。原因可能是7天时鸭子体内的母源抗体会降低，免疫系统也趋于成熟，所以此时的免疫反应较好。在1天时免疫2个剂量的疫苗，虽然只产生较低的抗体反应，但免疫鸭没有发病和死亡。

在北京鸭上使用全病毒灭活疫苗和/或禽痘重组病毒疫苗，评估不同免疫接种程序的效率［8］。研究表明，多种试验的免疫接种程序都可以提供完全的保护，没有出现临床症状和排毒。然而，禽痘病毒载体疫苗首免、灭活疫苗加强免疫的鸭子，诱导的抗体应答最广，表明这种首免-加强免疫的策略可以诱导针对H5的最佳免疫力。此外，该免疫接种程序在1日龄试验鸭上也能诱导很好的免疫力。

2.4疫苗和攻毒病毒之间的同源性

HA蛋白序列决定了病毒与疫苗之间的同源性。虽然遗传和抗原距离之间有一定相关性，但也有可能仅仅一个氨基酸导致的特定遗传差异就会导致抗原性的明显不同［9］。已经发现流感的抗原距离与HI滴度的对数呈线性相关，这一理论是构建抗原图谱的基础。HI试验中当抗原差异2个以上滴度时，人流感疫苗就需要更新。因为禽和人类在免疫接种中有很多差异，还不清楚这个标准是否适用于禽流感疫苗。

大多数疫苗研究中使用的疫苗，与攻毒病毒都有较高的同源性。对遗传距离较大疫苗的有效性研究较少。Beato等［10］使用H5N2病毒制备的疫苗，与H5N1攻毒病毒HA1蛋白同源性为89%，攻毒后没有分离到任何病毒。另一项研究中使用H5N2疫苗株，其HA1蛋白与攻毒的H5N1 HPAIV同源性为84%，鸭免疫2周后不仅防止严重的发病和死亡出现，也显著减少了排毒和传播［11］。由于试验设计、疫苗、攻毒病毒不同，从这些研究中很难得出明确的结论。当前在鸡上使用疫苗的情况表明同源疫苗免疫可以获得最好的效果，疫苗与攻毒毒株的距离越远，保护效果越差。在鸭上接种疫苗也可能出现这种情况。

2.5佐剂

高效的疫苗不仅需要良好的抗原，也需要良好的佐剂来增强抗原的免疫原性。目前已经开发了多种禽流感疫苗，并在鸡上进行了优化，但在鸭子上可能还不是最优的。使用三种不同的佐剂（矿物油、Montanide ISA 70M VG、Montanide ISA 206 VG）制备疫苗，免疫SPF鸭和鸡，发现三种佐剂诱导的抗体滴度水平相当。

另一种增强疫苗免疫原性的方法，是在疫苗中使用细胞因子等免疫刺激分子。Qian等［12］构建了一个共同表达H5N1 HPAIV的HA基因和鸡IL-6基因的重组禽痘病毒（rFPV-AIH5AIL6），并在鸭上评估其免疫反应。与单纯表达HA基因的重组禽痘病毒疫苗相比，rFPV-AIH5AIL6疫苗可诱导更高的抗AIV HI抗体反应，增强淋巴细胞增殖反应，免疫保护效果更好。鸡IL-6可能是一个有效的佐剂，增强了禽痘病毒载体AIV疫苗在鸭上的免疫原性。Yao等［13］构建了编码H5亚型HA与CD154（CD40L）融合的嵌合蛋白DNA疫苗，并在北京鸭上评估其免疫原性和保护效果。该疫苗可以诱导针对不同遗传谱系的H5 HPAIV的保护，但也存在一些缺陷，如需要多个剂量的免疫，因此目前还不适用于临床使用。一些方法可以改善疫苗的免疫应答，如当番鸭免疫重组禽流感H5灭活病毒疫苗时，同时饲喂苏菲葡聚糖（一种增强免疫应答的多糖），也可以增强免疫反应。

2.6免疫覆盖率

对于H5 HPAI的防控，充分接种足够数量的鸭子来维持“群体免疫力”是必需的。当免疫鸭不能限制在一个生物安全的位置时，问题就变得复杂。一些国家经常在没有生物安全措施的开放水域饲养鸭，导致H5 HPAI的疫苗接种覆盖率较差，因此大量的鸭子对病毒易感，可以作为病毒储存库传播H5 HPAIV。实际生产中，蛋鸭和种鸭在幼龄时接种过疫苗，但成年鸭子常常没有进行足够的加强免疫。以肉类消费为目的水禽常常也不进行免疫接种。因此，实际生产中免疫接种可能永远不会覆盖所有的易感禽类，导致疫苗接种的效果大大降低。

3　小结

疫苗免疫接种在H5 HPAI的防控中发挥了重要作用。然而，由于免疫中存在实际困难，以及H5病毒快速的抗原漂移，致使家禽疫情仍有发生。临床和实验室评估结果表明，攻毒病毒、鸭的品种、免疫程序、疫苗是否正确使用、疫苗和流行毒之间的抗原同源性、疫苗中病毒抗原量、佐剂、是否加强免疫接种、免疫覆盖率等因素，都可能影响到H5疫苗免疫接种的效果，甚至造成免疫失败。

做好H5 HPAI的有效防控，除了开发有效的疫苗接种策略，如适合大规模疫苗接种的疫苗外，还应建立有效的控制程序，包括免疫后监测、严格的检疫、动物移动控制、增加生物安全、消除被感染动物和全面的公众教育等一系列综合措施。

［1］ Bublot M，Richard-Mazet A，Chanavat-Bizzini S，et al. Immunogenicity of poxvirus vector avian influenza vaccines in Muscovy and Pekin ducks［J］. Avian Diseases，2010，54（1 Suppl）：232-238.

［2］ Liu J，Chen P，Jiang Y，et al. A duck enteritis virus-vectored bivalent live vaccine provides fast and complete protection against H5N1 avian influenza virus infection in ducks［J］. Journal of Virology，2011，85（21）：10989-10998.

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［11］ Van der Goot J A，VAn B M，Stegeman A，et al. Transmission of highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in Pekin ducks is significantly reduced by a genetically distant H5N2 vaccine［J］. Virology，2008，382（1）：91-97.

［12］ Qian C，Chen S，Ding P，et al. The immune response of a recombinant fowlpox virus coexpressing the HA gene of the H5N1 highly pathogenic avian influenza virus and chicken interleukin 6 gene in ducks［J］. Vaccine，2012，30（44）：6279-6286.

［13］ Yao Q，Fischer K P，Li L，et al. Immunogenicity and protective efficacy of a DNA vaccine encoding a chimeric protein of avian influenza hemagglutinin subtype H5 fused to CD154 （CD40L）in Pekin ducks［J］. Vaccine，2010，28 （51）：8147-8156.

（责任编辑：朱迪国）

Vaccines Against Duck H5 Subtype Highly Pathogenic Avian Inf uenza and Factors Inf uencing Its Eff ciency

Jiang Wenming，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Domestic ducks play an important role in the epidemiology of H5N1 highly pathogenic avian influenza （HPAI）viruses. Consequently，successful control over H5N1 HPAI in ducks is important for the eradication of the disease in poultry and for preventing infections in humans. Here we reviewed the current situation and progresses on duck H5N1 HPAIV vaccines and the factors that influence the efficiency of vaccines，including types of vaccines，duck species，vaccination schedules，homology between vaccine and challenge virus，adjuvants，and vaccination coverage.

duck；highly pathogenic avian influenza；H5；vaccination

S852.65

A

1005-944X（2015）12-0049-04

科技基础性工作专项（2012FY111000），青岛市科技计划（14-2-4-105-jch）

陈继明