壳聚糖/乙酸纤维素/银纳米线复合物的制备及抑菌性能探究

□巩亚明 张沓文 李 冬 张 潮 姜宇乘

壳聚糖是一种天然无毒的碳水化合物，具有良好的生物降解性和生物相容性。已有研究表明，壳聚糖具有抗菌活性，纤维素是一种由葡萄糖组成的大分子多糖，因为其良好的生物可降解性和生物相容性，可作为乳化剂、增稠剂及胶凝剂等被广泛应用。银纳米线作为唯一无机纳米材料，比纳米银粒子具有更好的粘性、强的附着力和韧性等特性。因此，本文设计以壳聚糖－乙酸纤维素共混物为基础上嵌入了银纳米线，将能够在提高抗菌性能的基础上同时提高复合物的机械性能，为下一步制备抗菌复合膜奠定基础。

一、实验部分

(一)主要实验原料及仪器设备。实验原料:壳聚糖(脱乙酰度85%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司);聚谷氨酸(分析纯，上海至鑫化工有限公司);冰醋酸(分析纯，上海振兴化工一厂);氢氧化钠(分析纯，上海振兴化工一厂);醋酸纤维素膜(分析纯，北京泛博生物化学有限公司);琼脂(分析纯，北京泛博生物化学有限公司)。仪器设备:磁力搅拌加热器(CJJ79 －1，杭州仪表电机厂);数显恒温真空干燥箱(DZF －150，郑州长城科工贸有限公司);箱式电阻炉(马弗炉，SX2 －2．5 －10，天津市中环实验电炉有限公司);超声波清洗器(KQ－100，昆山市超声仪器有限公司);恒温培养箱(DHP －9162，上海一恒科学仪器有限公司);超净工作台(SW －CJ －1FD，苏州净化设备有限公司);高压灭菌锅(LDZX －50KBS，上海申安医疗器械厂);恒温振荡摇床(ZWY－103B，上海智城分析仪器制造有限公司);傅里叶变换红外光谱仪(MAGNA － IR560E． S． P，美国Nicolet 公司)。

(二)银纳米线的制备。分析天平称取0．68g 硝酸银，溶解于60mL 乙二醇中。称取将pvp1． 766g 和4． 6mg 氯化钠于120℃磁力搅拌600r 的条件下溶解于40ml 乙二醇中。将该混合溶液在剧烈搅拌下缓慢滴入硝酸银乙二醇溶液中，搅拌5 分钟。然后将上述溶液转移到125mL 高压反应釜中，在160℃高温条件下反应7h，取出用甲醇洗涤三次，用丙酮在高速离心机上沉淀离心。得到银纳米线，备用。

(三)复合物的制备。取适量壳聚糖加入0．2 % 的乙酸溶液中，搅拌至溶解，配制浓度为1%(W/V)的壳聚糖溶液。取0．05g 乙酸纤维素，加入20mlN－N 二甲基酰胺中，在75℃水浴下搅拌直至溶解，然后将其混入壳聚糖的乙酸溶液中，充分搅拌。用旋转蒸发器除去N－N 二甲基酰胺，得到白色胶状物。

分别取为3ml、4ml、5ml 的银纳米线乙醇液，并混入白色胶状物，得到不同银纳米线参入量的壳聚糖/乙酸纤维素/银纳米线复合共混物。

(四)复合物的抑菌性能研究。

1．培养基的配制。牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏0．5%，蛋白胨1%，氯化钠0． 5%，pH 7．0 ～7．2，琼脂2%。

菌悬液的制备:一是菌种活化:在无菌环境下，挑取菌种涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上活化一代，于37℃培养24 ～48 h后观察。取单菌落接种于斜面上，备用。二是菌悬液的制备:用接种环勾取1 环大肠杆菌牛肉骨蛋白胨液体培养基中(不加琼脂)，于37℃培养24 ～48 h。

2．抑菌圈的测定。取直径为6 厘米的培养皿，然后将45°C左右的牛肉膏蛋白胨培养基倾注入培养皿，充分混匀待凝。将生长至对数期的大肠杆菌菌液取适量分别加入到固体培养基之上，用刮棒将培养基表面的菌液刮平整，在其上面均匀取四位置作为试验点，四个点分别为三个复合物和一个对照，将含有不同浓度实验制备的复合物的抗菌液均匀涂抹在直径为6mm 的圆形醋酸纤维素膜上并在室温条件下晾干，将4 片纤维素膜分别置于培养皿中的4 个试验点上，于37°C 培养12 h 和24h，观察抗菌膜周边的细菌的生长情况，记录抑菌圈的直径。

图1 银纳米线的UV－vis 图谱

二、结果与讨论

(一)银纳米线的UV－vis 图谱。从图1 中可以看到，银纳米线有两个明显的吸收峰，分别在353 和392nm 处，这与文献报道一致。其中，353nm 的吸收峰对应于银纳米线的四极矩共振激发引起的，而392nm 处的吸收峰可归结为银纳米线的横向等离子共振。

表1 复合物抑菌圈平均直径

(二)复合物的抗菌实验结果。本实验以大肠杆菌为实验对象，采用抑菌圈法考察壳聚糖/乙酸纤维素/银纳米线复合物的抗菌性能。将不同银纳米线掺入量的复合物，以及壳聚糖对照分别均匀涂抹在直径为6mm 的圆形灭菌后的醋酸纤维素膜上，置于试验点上于37°C 培养24 h，观察抗菌膜周边的细菌的生长情况。壳聚糖/乙酸纤维素/银纳米线复合物培养12h、24h的抑菌圈结果，平均抑菌圈直径结果见表1。

当培养时间为12h 时，不同银纳米线掺入量的复合物不同程度地在醋酸纤维素膜周边形成了抑菌圈，其中银纳米线使用量为5mL 时，复合物的抑菌圈直径最大，抑菌效果最明显，当银纳米线使用量为3mL 时，复合物的抑菌圈直径最小。结果表明，所制备的复合物随着银纳米线掺入量的增大，抑菌圈直径也增大。当培养时间为24 h 时，培养基开始出现菌落的生长，而醋酸纤维素膜周边依然存在明显的抑菌圈，没有生出任何的菌落，其分布规律及抑菌圈直径与培养12 h 时基本一致，说明所制备的复合物具有良好的抑菌效果，且具有持效性。