2015年版《中国药典》无菌检查法解读

2015-01-23杨晓莉李辉绳金房钱维清胡昌勤

中国药业 2015年24期

关键词：检查法药典无菌

杨晓莉，李辉，绳金房，钱维清，胡昌勤

（1.陕西省食品药品检验所，陕西西安710065；2.上海市食品药品检验所，上海201203；3.中国食品药品检定研究院，北京100050）

2015年版《中国药典》无菌检查法解读

杨晓莉1，李辉1，绳金房1，钱维清2，胡昌勤3

（1.陕西省食品药品检验所，陕西西安710065；2.上海市食品药品检验所，上海201203；3.中国食品药品检定研究院，北京100050）

目的解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况。方法对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异。结果2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订。结论2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法。

无菌检查法；2015年版《中国药典》；无菌药品；培养体系；质量控制

无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。笔者对比了2010年版《中国药典》［4］，解读2015年版《中国药典》无菌检查法增修订概况，以推动新版药典的贯彻实施。

1　检测范围和环境要求的变化

1.1检测范围

2010年版《中国药典》无菌检查法的相关内容统一为新的标准方法，解决了长期以来各部之间相同方法要求不一致的问题，其检查范围增大，要求更明确、严格。除了规定药典要求无菌的药品、原料、辅料、生物制品及其他品种外，还将无菌医疗器具明确纳入检查范围。无菌医疗器具与无菌药品的使用密切相关，影响着无菌药品的安全使用。医疗器具在提高救治质量的同时，也可能成为环境病原菌的传播工具，造成医院感染的发生［4］，新的要求必将严格无菌医疗器具的监管，降低安全风险。

1.2环境要求

新版药典无菌控制理念要求检测环境应与检测需求相适应，体现科学、合理的原则。目前，国际上对无菌检测环境无明确要求，但原则上无菌检查的试验环境应不低于无菌药品的生产关键区域环境。相比2010年版《中国药典》规定的无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级单向流空气区域内进行的要求，2015年版《中国药典》中规定“无菌检查应在无菌条件下进行，实验环境必须达到无菌检查的要求”。无菌检查条件和无菌检查具体要求应是什么呢？2015年版《中国药典（四部）》通则9 203药品微生物实验室质量管理指导原则中给出了具体指导意见，无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域或隔离系统中进行。新版药典这一要求比之前的环境要求更严格，在无菌操作、预防措施、洁净度确认、隔离系统验证和环境监控等方面要求一致。新版药典在通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则和9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则对试验环境和环境监控有更详细、具体的指导，增强了方法的可操作性、实用性、可靠性和规范性。

2　培养体系的变化

培养体系主要包括培养基、培养时间和培养温度等方面，微生物培养体系的差异导致了2010年版《中国药典》与国外药典无菌检查法的系统性差异，检查结果之间存在不确定性及不可比性。随着国际贸易的日益频繁，中外药典微生物培养体系的一致性需求成为一种趋势，新版药典无菌检查法微生物培养体系与国际通用标准一致。

1）无菌检查用培养基

2015年版《中国药典》无菌检查法规定，以硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基作为无菌检查的2种主要培养基，其中硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，胰酪大豆胨液体培养基主要用于需氧菌和真菌的培养，纠正了我国长期存在的将微生物划分为细菌和真菌的概念，以培养基的促生长能力和微生物的生长需要作为分类依据，将产品中可能污染的微生物在无菌检查中按需氧菌、厌氧菌和真菌进行培养。硫乙醇酸盐流体培养基自20世纪50年代起，国内外药典陆续将其收录，用于药品的无菌检查。但研究发现，其存在局限，该培养基并不能使所有的梭状芽孢杆菌生长，并提出应同时使用胰酪大豆胨液体培养基作为补充，这一建议随后被国外药典采纳。但该培养基之所以能沿用至今，是因为其具有不可替代的优势，硫乙醇酸盐流体培养基能在普通有氧环境下提供厌氧条件，使需氧菌和厌氧菌均能生长良好，并易于观察结果，这提供了一般实验室难以达到的厌氧培养条件［5-6］。试验证明，2010年版《中国药典》无菌检查法所用改良马丁培养基与国外药典胰酪大豆胨液体培养基虽然在促微生物生长能力（灵敏性）和适于微生物生长的种群（广谱性）上无显著性差异，但胰酪大豆胨琼脂培养基的菌落形态较典型，且在培养霉菌方面略优于改良马丁培养基，且胰酪大豆胨液体培养基pH值为7.3±0.2，改良马丁培养基的pH值为6.4±0.2，更接近中性的pH环境，适宜于需氧菌和真菌的生长［7-9］。为与国际标准接轨，新版药典无菌检查用培养基将胰酪大豆胨液体培养基取代了2010年版《中国药典》收载的改良马丁培养基。

新版药典无菌检查用培养基中对原来的“选择性培养基”名称进行了更正。因为选择性培养基是指能允许特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他微生物生长的增菌培养基。而2010年版《中国药典》及以前各版无菌检查法一贯收载的“选择性培养基”实际上是指为消除供试品的抑菌性而在原有培养基中加入中和剂、灭活剂后的培养基，不是严格意义上的选择性培养基，新版药典将其更名为准确的“中和或灭活用培养基”。

另外，新版药典无菌检查法中还规定培养基的pH值应在25℃测定。因温度对pH值有影响，培养基在配制过程中需要经过加热、溶解、灭菌等一系列处理，规定25℃的pH值也是对培养基质量提出了更严格的要求。

2）菌液制备用培养基

由于培养体系的变化，菌液制备所用的培养基、培养条件等要素也做了相应调整。其中用胰酪大豆胨液体培养基替代营养肉汤培养基，胰酪大豆胨琼脂培养基替代营养琼脂培养基，沙氏葡萄糖液体培养基替代改良马丁培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基替代改良马丁琼脂培养基。新增沙氏葡萄糖琼脂和沙氏葡萄糖液体培养基用于白色念珠菌和黑曲霉菌的菌液制备。

3）培养温度

温度是影响微生物生长的关键因素，与医药相关的微生物大多是嗜温的，其最适温度在环境温度和体温之间［10］。绝大多数微生物最适生长温度为25～37℃。2015年版《中国药典》硫乙醇酸盐流体培养基规定的培养温度与2010年版硫乙醇酸盐流体培养基规定的培养温度一致，为30～35℃，生物制品需增加1份20～25℃培养。但胰酪大豆胨液体培养基规定的培养温度为20～25℃，不同于原改良马丁培养基的培养温度23～28℃。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌和大肠埃希菌最适生长温度为37℃，白色念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28℃，均为嗜温型微生物。微生物在最适温度生长最快，超过最适温度，热会破坏菌体的某些蛋白质而使细胞活力丧失，微生物生长的最适温度通常与规定的最高温度相对较近而与规定的最低温度相对较远。一般略低于最适温度对微生物生长影响不大，而高于最适温度会对微生物生长产生较大影响，因此结合培养基的促生长特性，尽量全面地覆盖微生物检出的种类和数量，无菌检查规定的培养温度20～25℃和30～35℃满足试验要求。

4）培养时间

在适宜培养条件下，细菌的群体生长数量与培养时间的关系遵循生长曲线规律，延长培养时间有利于微生物的检出［11］。无菌产品中的微生物在生产工艺过程中会受到损伤而处于亚致死状态，受损微生物菌体在开始繁殖前需要有一段修复损伤的时间，一般标准方法中推荐的通常只是多数细菌恢复生长的最佳时间。如果减少培养时间会导致菌体生长数目大量减少，在定性试验方法中，导致假阴性结果。方法适用性下规定的培养时间为不得超过5 d。

5）培养环境

氧气作为许多微生物的最终电子受体，是其生长的重要影响因素，如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。但有一些微生物，氧气的存在不利于其生长，如生孢梭菌等。另有一些微生物的生长也可不依赖氧气的存在，属兼性厌氧菌，如大肠埃希菌、沙门氏菌等。在培养环境中不同微生物对氧气的依赖程度不同，影响微生物的生长速率和状态的程度也不同。液体培养基煮沸可将溶解氧去除，硫乙醇酸盐流体培养基与胰酪大豆胨液体培养基在配制时需要煮沸。硫乙醇酸盐流体培养基中的还原剂巯基乙酸钠能形成-200mV或更低的氧化还原电位，以减少或清除氧或氧化分子对厌氧微生物生长的抑制作用。胰酪大豆胨液体培养基配制时微温溶解，培养基中有一定的氧含量，有利于需氧菌、微需氧菌和兼性厌氧菌等其他微生物的生长。新的培养体系提供了覆盖更全面、更普遍的微生物培养环境，有利于污染菌的检出。

3　方法适用性试验的变化

3.1名称的修订

2015年版《中国药典》无菌检查法将方法验证试验修订为方法适用性试验。验证与适用性均是为保证方法的合理、有效而对方法进行的测评，然而其侧重点不同。方法学验证是通过实验证明方法的运行符合分析应用要求的过程，侧重于方法本身的科学性。适用性把仪器确认、电子系统、分析方法、操作、样品等因素作为一个整体的系统来评价，控制分析条件诸因素的影响，使检测活动能达到预期目标。方法适用性试验包含方法验证试验，范围更广，层次更高，更为全面的质量控制策略。分析方法验证、转移和确认的概念不同，适用范围不同。方法确认的目的是证明药典分析方法或法定分析方法适用于被测样品，被测样品的质量可控，方法可行，同时还证明方法使用人员有能力成功地操作药典分析方法或法定分析方法［12］。新版药典将原来的“验证、证明”的表述修订为“确认”，更准确。

3.2菌种及菌液制备

增加了pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为菌液制备中的稀释剂和洗脱剂，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液除了能提供适宜的渗透压、良好的细胞修复环境外，还消除了微生物培养过程中积累的代谢产物引起的酸碱度变化而带来的不利影响。方法适用性试验使用的菌种与培养基灵敏度使用的菌种略有不同，方法适用性试验以大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌为假单胞菌属菌种，对很多抗生素都天然耐药，药物敏感度不高，不适合做方法适用性。但假单胞菌属的细菌对培养体系的营养要求高，所以适合做培养基适用性检查。

3.3薄膜过滤法

薄膜过滤法是历版《中国药典》收载的无菌检查法的首选方法，其具有操作简便、结果准确等优点，尤其是全封闭式薄膜过滤器具有不易污染的优势而在薄膜过滤法中得到广泛应用，新版药典删除了“取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中”，淘汰了开放式薄膜过滤的操作方式。另外，在培养时间上要求不得超过5 d，对方法适用性试验进程提出了比较灵活的要求。

3.4直接接种法

当样品的性状不允许，且经多种方法前处理后仍无法采用薄膜过滤法的供试品，可采用直接接种法［13］，由于培养体系的不同，方法适用性试验所使用的培养基的接种管数也与2010年版《中国药典》规定的接种管数有差异。2010年版规定为硫乙醇酸盐流体培养基8管，改良马丁培养基4管；2015年版为硫乙醇酸盐流体培养基与胰酪大豆胨液体培养基各6管。

4　供试品无菌检查的变化

4.1检验数量

检验数量是指一次试验所用供试品的最小包装容器的数量。2015年版《中国药典》增加了新的要求，即：成品每亚批均应进行无菌检查。因为在实际中，为完成某些生产操作步骤，可能有必要将1批产品分成若干亚批，最终合并成为1个均一批。无菌检查是通过抽取1批产品中的部分样品检测来推断整批产品是否无菌的统计学过程，因此如果检验数量与所对应的实际批量不符（亚批的状况），就会导致产品通过无菌检查的概率升高。对于亚批无菌检查的特别规定，体现了药品安全从严控制的理念。无菌检查法中“表1批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量”与“表2上市抽验样品的最少检验数量”专门用来描述对于检验数量的规定，无菌检查试验供试品的检验数量不能低于药典规定的最少检验数量。

4.2检验量

2010年版《中国药典》无菌检查法中的检验量是指1次试验所用的供试品总量（g或mL），这显然与“表2液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量”和“表3固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量”所表达的“每支供试品接种每种培养基的最少量”不完全相符，表达不够准确。新版药典检验量的概念结合无菌检查法的特点和供试品的特殊性，定义为供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或mL），详细清晰地表述了检验量为每个最小包装接种至每份培养基的供试品量的下限。只要供试品特性允许，应将所有容器的全部内容物过滤，这有利于污染菌的检出。删除了“薄膜过滤法检验量应不少于直接接种法的供试品总量”的表述，一般来说，薄膜过滤法具有适用于检验量较大的供试品无菌检查，该方法总检验量通常都不会少于直接接种法的总检验量，因此，2015年版《中国药典》关于该问题不再赘述。

4.3阳性对照

2015年版《中国药典》无菌检查法将阳性对照菌的选择细化，将原来抗细菌的供试品，以金黄色葡萄球菌为阳性对照修订为无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌，抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌，再加上抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照菌，这样就使供试品对照菌的选择更科学，对方法的控制更具针对性。阳性对照试验的设置是必要的，是单次试验条件下检测方法有效的有力证据。对于某些具有抑菌性的药物，若阳性对照呈阳性生长，则证明所采取的稀释、中和、灭活等去除抑菌性的方法是有效的。

4.4供试品处理及接种培养基

该项下主要描述了无菌检查前，需要对样品进行消毒处理以避免人为污染而影响结果的准确性。同时，提供了容器内具有一定真空度供试品的前处理方法。该部分属于文字及编排顺序的变更，内容无实质性变化。

4.5薄膜过滤法

随着科技水平的发展，封闭式薄膜过滤器因其不易污染、操作方便等优势逐渐取代了一般薄膜过滤器，因此新版药典无菌检查法不再收载一般薄膜过滤器及其相关操作。对于水溶液供试品，明确了“可直接过滤，或混合至100mL适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。这样可使样品充分分散。整合了2010年版《中国药典（三部）》关于生物制品薄膜过滤法和接种培养基的规定。总结近年来医疗器具无菌检查的实践经验，可联合使用薄膜过滤法和直接接种法，增加了具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品无菌检查方法的规定。

4.6直接接种法

新版药典明确了直接接种法的适用范围，即直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。直接接种法操作相对烦琐，加入中和剂或灭活剂等处理时经常会出现其他影响结果观察的状况，因此删除了关于去除抑菌性的相关规定。但直接接种法在进行固体制剂、非水溶性供试品、敷料、肠线、缝合线、灭菌医用器具、放射性药品等特殊样品的无菌检查时有其明显优势。限定样品的加入量与培养基体积的比例不大于10%，以避免培养基促生长能力的减弱或是不利于微生物生长的过高渗透压。

4.7表1，2，3的变化

2015年版《中国药典》整合了原表1，2，3的相关内容及生物制品的有关规定，重新形成了新的表1，2，3，分别为表1批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量，表2上市抽验样品的最少检验数量，表3供试品的最少检验量，在表2和表3中合并了固体制剂和液体制剂，将上市抽验样品的最少检验量独立成表2，将最少检验量和最少检验数量分开表述。表1，2均为形式上的整合，内容上基本无实质变化。表3中参考USP重新调整了液体制剂供试品装量所对应的每支供试品接入每种培养基的最少量，整体上看，较小规格（V<100mL）最少检验量有所增大，增加检验量有利于污染微生物的检出，大规格（V>100mL）有所减少，主要是为保护滤膜的完整性和截留微生物不会受到较大体积液体滤过的影响，同时，也有利于一些不易通过滤膜（如脂肪乳样品）的无菌检查。带导管的一次性医疗器具（如输液袋），要求每支供试品接入每种培养基的最少量为1/2的内表面积，相比之前要求更为科学、详细。

4.8培养与观察的变化

无菌检查试验中微生物培养时间是理论与经验的总结，新版药典无菌检查法规定培养时间为14 d，如培养14 d后不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，再培养3 d观察结果，这有别于2010年版《中国药典》培养14 d转种后细菌培养2 d，真菌培养3 d的规定。新版药典在培养及观察项下还要求对接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成2等份，1份置30～35℃培养，1份置20～25℃培养。

5　偏差调查与菌种鉴定

2010年版与2015年版《中国药典》在结果判断上无变化，但更加强调了偏差调查。如果无菌产品的无菌检查结果异常，应开展偏差调查。偏差调查关系着产品质量及质量管理体系的良好运行。偏差分析实施的过程可以概括为如下流程：偏差确认→偏差评估→实验室调查→全范围偏差调查→总结调查结果（纠偏措施+决定放行）［14］。微生物实验室的偏差调查应对试验进行全面回顾和溯源，从人员、检验方法、方法理解、注意事项、操作程序、仪器材料、对照试验、试验环境、培养基、试验菌株等方面进行调查，查找原因深入分析，并及时采取纠偏措施，形成调查报告。一个完整的偏差调查报告至少应包括偏差概述、偏差调查（如果是试验过程污染经进行菌种的相关鉴定，查找污染源）、偏差分析、结论与纠偏措施、纠偏结果的微生物学评价及建议措施。如实验室调查确认异常/超标结果并非试验偏差，则微生物实验室要联合质量管理部门和相关人员进行全面调查并形成调查报告［15］。无菌检查以1次检查为准，不允许复试。但若试验经确认无效，可重试。对阳性结果分离的微生物进行鉴定，以判断试验是否重试。实验室要结合具体状况选择适宜的方法对疑似菌确认，出现争议时以现行版《伯杰氏系统细菌学手册》为准［2015年版《中国药典（四部）》通则9204微生物鉴定指导原则］。在微生物鉴定相关的核酸、脂肪酸，蛋白质的分析仪器设备基础上建立起来的仪器分析法是菌种（株）鉴定未来发展的方向。现阶段的API检测是细菌鉴定的常用方法，16SrDNA测序技术的应用也发展成熟，傅里叶红外微生物溯源分析系统等也发展较快。文献报道，生化鉴定操作相对复杂烦琐，而16SrDNA测序技术鉴定细菌具有高效、准确、简便、特异性强等优势［16］，再辅以血清学实验或其他分子生物学技术，能对细菌进行分型鉴定。药品微生物实验室在药品无菌检查的偏差调查时可根据自身的实验条件和实验目的，结合16SrDNA测序和生化鉴定，选择适合的菌种鉴定方法。

6　无菌产品的全过程控制

无菌是指物品灭菌或除菌后不含活的微生物，如微生物和无菌检查所用的物品经灭菌处理后不得含活的微生物，但在实际中没有绝对无菌的存在，无菌产品的无菌性常以无菌保证水平（SAL）来表示，通常为10-n，一般采用终端灭菌的产品其SAL≤10-6，即在百万件或以上物品中最多只允许有1件物品仍存在活微生物，视为合格［17］。由于无菌检查法在采样、培养条件等方面存在先天缺陷［18］，无菌产品的微生物安全性不能仅依赖于无菌检查，应强调产品的全过程控制。无菌检查是为了证明一个否定的结论，是一个推断的统计学检测结论，对于终端灭菌的产品这一假设是合理的，但前提是灭菌器的热量分布均匀，或射线剂量分布均匀。参数放行需要反复、定期的监控和证明，为终端灭菌产品进入市场提供了依据。因此现阶段下，结合我国国情，强调无菌产品的全过程质量控制理念，尽可能从设备、物料、环境、人员、技术、方法等角度达到对无菌产品生产工艺过程进行持续监控，以提高无菌检查结果的可信度，从根本上保障无菌产品的安全性和有效性。

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