热应激抑制哺乳动物早期胚胎发育的作用机理及Hsp70的保护作用

屈平平，李　涛，胡士林

(山东畜牧兽医职业学院， 山东 潍坊 261061)

热应激抑制哺乳动物早期胚胎发育的作用机理及Hsp70的保护作用

屈平平，李涛，胡士林*

(山东畜牧兽医职业学院， 山东 潍坊 261061)

夏季高温是哺乳动物的繁殖性能降低的重要原因。热应激通过诱导氧化应激、促使细胞凋亡、阻碍细胞有丝分裂等机理抑制早期胚胎发育。而热休克蛋白70可以通过分子伴侣作用、诱导热耐受性、抑制细胞凋亡、抵抗氧化应激、参与细胞增殖等方式发挥其对胚胎的保护作用。

热应激；哺乳动物；早期胚胎；热休克蛋白70

高温热应激是夏季哺乳动物不孕和妊娠失败的主要原因之一。研究表明，热应激能降低公畜的精液品质和母畜的卵母细胞质量，使得卵母细胞受精能力和受精后胚胎的发育能力降低[1,2]；母畜在妊娠早期遭受热应激后，胚胎的死亡率和畸形率也明显增加[3]。但是，哺乳动物早期胚胎对热应激的敏感性具有发育阶段性，当胚胎发育至囊胚时，可以通过短暂的温和热应激诱导胚胎获得一定的热耐受性，有与热休克蛋白70的保护作用有一定的关系。

1　热应激抑制哺乳动物早期胚胎发育的作用机理

1.1诱导氧化应激

活性氧是天然氧代谢的产物，代表着1%～2%的代谢氧。氧化物质的产生和及时清除维持着细胞内环境稳定。当自由基产生增多，清除能力下降时，自由基就会在体内积蓄，影响细胞及细胞器正常的生理结构和功能。动物遭受热应激时，机体的代谢率增加，细胞温度升高，激活了许多促使自由基产生的酶如黄嘌呤氧化酶，使得机体活性氧产生增多；活性氧再与脂质、蛋白质和核酸一起作用，导致细胞发生损伤。自由基的增多对体外培养的胚胎是致命的，通常会导致胚胎发育阻滞和胚胎退化。Ozawa等发现，母体热应激后受精卵和2-细胞期胚胎内谷胱甘肽水平下降，过氧化氢水平升高(分别于热应激后立即检测和热应激后恢复12 h检测)。相反，体外小鼠受精卵和2-细胞期胚胎遭受相同强度热应激后，谷胱甘肽水平和过氧化氢水平与正常培养组差异不显著[4]。可能是热应激诱导母体生殖道内环境的生理生化条件发生变化，胚胎内氧化应激加强，最终导致胚胎发育能力降低。研究已证实，热应激致使胚胎内过氧化氢含量升高[5]，抗氧化剂谷胱甘肽含量降低。在培养液中添加抗氧化剂可以增强胚胎对热应激产生的耐受性，而抑制胚胎谷胱甘肽的合成会导致胚胎对热应激的耐受性降低。另外，与体细胞不同的是，附植前胚胎不能自发合成谷胱甘肽，其抵抗氧化应激的能力更弱。因此，早期胚胎对热应激诱导的氧化应激是非常敏感的，这也是高温抑制早期胚胎发育的原因之一。

1.2促使细胞凋亡

热应激能诱导多种细胞发生凋亡，包括卵母细胞和附植前的胚胎[6-8]。热应激诱导的细胞凋亡是胚胎发育过程中抵抗热应激的一种自我保护方式；热应激时胚胎细胞凋亡的程度还能反映出胚胎对热应激的敏感性。正常的细胞凋亡在哺乳动物发育过程中作为一种质量控制机制，用于清除体内损伤的、无功能的、异常的、错位的细胞[9]。热应激严重损伤的细胞如果不能发生细胞凋亡，通常会引发坏死。但是，热应激诱导细胞过度凋亡也会影响到胚胎的正常发育。Roth等发现，40℃和41℃热应激的卵母细胞的TUNEL阳性率高于38.5℃组。在卵母细胞成熟培养基内加入CaspasesII抑制剂后，分别在38.5℃和41℃条件下成熟和受精，当胚胎培养至第8d时，CaspasesII抑制剂能阻断热应激对卵裂率和囊胚率的影响。说明卵母细胞成熟期间热应激能促使Caspases II介导的细胞凋亡，而导致卵母细胞受精后早期胚胎发育能力下降[10]。热应激诱导的细胞凋亡是热应激对早期胚胎最为常见的一种损伤之一，并且热应激诱导的细胞凋亡不但具有发育阶段特异性，还与热应激的强度和持续的时间密切相关。Hansen等(2004)对不同发育阶段的牛胚进行不同强度热应激处理时发现，41℃热应激9 h和42℃热应激9 h对2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎及受精后第3 d收集的8-细胞期胚胎和16-细胞期胚胎的细胞凋亡没有影响；40℃热应激80 min对受精后第4 d收集的8-细胞胚和16-细胞胚的细胞凋亡也影响不大，但41℃热应激9 h能够导致该时期胚胎细胞凋亡率增加，另外，在该阶段40℃预热应激80 min能抑止41℃热应激9 h诱导的细胞凋亡；16-细胞期以后的胚胎经相同热应激处理后，细胞凋亡数明显增加，胚胎总细胞数也显著降低[11]。并且，42℃热应激组凋亡细胞率随着热应激时间的延长而增加。热应激不能诱导2-细胞期胚胎和4-细胞期胚胎发生细胞凋亡与CaspasesII活性缺乏有关。Caspases没有活性并不表明缺乏Caspases酶原或缺乏激活Caspases的信号传导通道。蛋白激酶C的抑制剂十孢子碱能诱导小鼠受精卵至4-细胞期胚胎和牛的受精卵至16-细胞期胚胎发生细胞凋亡[12]。另外一种可能是早期胚胎中抗细胞凋亡蛋白含量比较高，在胚胎发育过程中，这种蛋白的含量降低，以致热应激诱导细胞凋亡成为可能。将第4 d的8-细胞至16-细胞期的胚胎经过温和的、短暂的热应激(40℃热应激80 min)处理能阻断后来更为严重的热应激(41℃热应激9 h)诱导的细胞凋亡。这种现象在其他细胞中也有发生。我们推测，适当的预热应激能保护随后强烈热应激诱导的细胞凋亡的生化机制可能与HSP70有关[13-16]。

1.3阻碍有丝分裂

哺乳动物早期胚胎遭受热应激后，其囊胚率和孵出率降低，胚胎总细胞数也明显减少，说明热应激抑制了胚胎细胞的进行有丝分裂和增殖。其机制可能是热应激破坏了细胞有丝分裂装置，如中心体、纺锤体、细胞骨架成分等。细胞骨架成分对热应激非常敏感。而细胞骨架成分在细胞分裂活动中起着重要的作用。处于有丝分裂S期的体细胞遭受热应激后，会导致染色质提前浓缩和微核形成。处于有丝分裂M期的细胞遭受热应激后会导致有丝分裂纺锤体分解，形成多倍体，胞质分裂失败。添加微管抑制剂[17-18]和微丝抑制剂[19]能破坏核成熟。41℃～41.5 ℃热应激会导致已成熟牛卵母细胞[20]，正在成熟的猪卵母细胞[21]及2-细胞期牛胚[22]的微丝和微管结构改变，说明细胞骨架的破坏抑制了细胞有丝分裂的进程。另一方面可能是热应激导致细胞有丝分裂的相关细胞因子失调，如Cdc2活性降低(细胞成熟促进因子MPF的催化亚基，诱导细胞进入有丝分裂)，CyclinsA/B(细胞周期调节蛋白)水平升高。真核细胞分裂，包括胚胎分裂，是由MPF激酶的活动所调控，MPF激酶有两个亚基CyclinB1和Cdc2组成。在细胞有丝分裂的G1期、S期和G2早期，Cdc2是磷酸化状态，MPF激酶活性很低；在G2晚期，Cdc2是去磷酸化状态，与CyclinB1结合，使得细胞周期通过M期。将小鼠受精卵暴露于热应激导致体外发育阻滞在2-细胞期。目前研究证实，发育阻滞的2-细胞期胚胎在第二个细胞周期时Cdc2很低[23]。但是，在培养液中添加于Cdc2活性相似的SOD或硫氧还蛋白，可以使发育阻滞的胚胎通过第二次细胞有丝分裂。第二个细胞周期G2期Cdc2的失活是2-细胞期胚胎发育阻滞的直接原因之一。

2　热应激诱导的热休克蛋白70表达对细胞的保护作用

虽然热应激会对哺乳动物早期胚胎造成一定的损伤，但是胚胎本身还能对热应激源做出保护性应答反应，其中热休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsps)就是应答反应的主要产物之一。其中Hsp70家族是附植前胚胎主要表达的保护性蛋白之一。Hsp70-2仅限于热休克状态表达，Hsp70B基因和Hsp70B'基因，为严格热诱导表达，无基础表达。结构型Hsp70在植入前各期鼠胚胎中均有表达。诱导型的Hsp70在胚胎发育到8-细胞期胚胎时才能检测到。Hsp68能在2-细胞期小鼠胚胎自发表达，但Hsp68的表达是暂时的，在4-细胞期时即停止表达，在囊胚期后(含囊胚期)Hsp68才能被诱导表达。结构型Hsp73 通常在神经管闭合、神经外胚层分化和增殖过程中有较高水平的表达，位于细胞浆和细胞核内，参与神经元的分化。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-Regulated Protein，GRP78)和GRP75在胚胎发育阶段也有表达，其中GRP75定位于小鼠18号染色体。Hansen等在2-细胞期牛胚的培养液里加入诱导型的Hsp70抗体后发现2-细胞期牛胚发育到囊胚的百分率明显降低[24]。Neuer等用抗鼠Hsp70单克隆抗体与2-细胞期鼠胚共同培养，在受精后第5d时囊胚孵出率明显降低，说明Hsp70抗体对鼠胚生长产生强抑制作用。Mirkes等发现诱导型Hsp70的转基因小鼠可以防御由高热引起的胚胎致死效应。还有很多类似的试验证明Hsp70对胚胎发育具有保护作用。Hsp70主要从以下几个方面保护胚胎免受热应激损伤。

2.1分子伴侣功能

在正常未受应激的细胞中，Hsp70家族成员参与两种伴侣功能。首先，Hsp70与核糖体上新生多肽结合，保证新合成蛋白正确折叠[。其次，Hsp70分子携带着蛋白质，运送到不同的细胞区室，包括陪伴蛋白跨膜转运，或通过核膜孔，还有与小泡循环中的网格蛋白相互作用。内质网上Hsp70家族的代表性成员BiP(或GRP78)的分子伴侣功能是将蛋白转运过网膜和在网腔内再折叠和组装蛋白。因此，Hsp70对调节蛋白内环境的稳定具有重要作用。哺乳动物早期胚胎在热应激条件下能诱导合成大量的Hsp70，而其它蛋白质的合成暂时停止或减弱。新合成的Hsp70通过在胞质中识别和结合某些未折叠的多肽链，阻止其不可逆的变性和聚集，同时还促进热变性蛋白质的降解和清除，重新激活某些酶以维护细胞的功能和生存。热应激停止后，Hsp70通过ATP供能帮助折叠错误的蛋白质解开，促进其正确折叠和装配。

2.2诱导热耐受性

哺乳动物细胞急性持续的暴露于高热环境中,将导致细胞功能减低或丧失，最终导致细胞死亡；而当这些细胞间歇性地暴露于热环境中(其中间隔数小时生理温度)，这些细胞将产生耐热性(Thermotolerance)。在34℃下热适应30d的大鼠，再急性暴露于41℃1～48h，与未经热适应的对照组大鼠相比发现，细胞内Hsps的基础水平升高140%，其中Hsp70升高速度明显加快，应激后lh即达最大表达水平，而对照组则需4h才能使Hsp70 表达量达到最高水平。把雏鸡每天进行短时间的热应激处理时发现，3周后细胞内Hsp70 mRNA的表达显著升高。将重组的诱导型Hsp70基因转入鼠成纤维细胞，发现Hsp70表达增加，成纤维细胞对热应激的抵抗能力增强。Browder等比较不同发育阶段海胆胚胎热应激后的发育状况，结果从受精卵到囊胚胎期前的任何阶段都未发现Hsps的诱导合成，此期胚胎死亡及异常高达99%，但在囊胚期及其以后，热应激可以诱导Hsps合成，胚胎成活及正常发育率达99%以上。将Hsp70 mRNA注入到鼠的胚胎可以增加了胚胎对热应激的抵抗力。纤维原细胞显微注射Hsp70抗体后，其对热休克的敏感性增强，而显微注射Hsp70 mRNA能诱导纤维原细胞产生热耐受性。说明Hsp70能够增加细胞对热应激的耐受性。因此，将胚胎经过适当的温和热应激处理后，可以抵抗随后更大强度的热应激，提高胚胎在各种热环境下的存活率。

2.3抑制细胞凋亡

有研究发现，细胞内Hsp70水平升高能阻断导致细胞凋亡的细胞内应激激酶(Jun N-terminal Kinase，JNK)信号通路，抑制应激诱导的JNK激活，从而减少细胞的凋亡。向培养液中加入Hsp70抗体后，胚胎细胞凋亡增多，囊胚率明显降低[25]。Hsp70还能抑制另一种应激激酶P38的活性，当Hsp70家族单抗存在时，这种抑制作用则消除，P38活性升高，细胞损害严重。Hsp70还能阻断细胞氧化酶C从线粒体上释放，激活无活性的Caspases-3前体、应激蛋白激酶和C-JUN氨基端激酶(SAPK/JNK)，干扰细胞色素C结合凋亡蛋白酶活化因子1，抑制细胞凋亡；Hsp70还可以通过防止线粒体的Bax基因上调，抑制应激诱导的细胞凋亡。

2.4抵抗氧化应激

Hsp70在细胞内具有抗氧化的生物活性，能保护细胞抵抗应激损伤。研究表明Hsp70可促使机体内源性抗氧化剂(如超氧化物歧化酶，Super Oxide Dismutase，SOD)合成和释放，还可抑制氧自由基的关键酶(如NADPH 氧化酶)的产生，通过反馈作用减少氧自由基的产生。Hsp70还可以减少Ca2+进入细胞，保护细胞免受由活性氧族(ROS)介导的Ca2+细胞内流所引起的细胞毒性和细胞死亡。热应激预处理过的细胞，可以耐受H2O2对细胞膜的损伤，就是因为进入细胞的Ca2+减少。并且现已证实，诱导型Hsp70是通过提高细胞膜的蛋白转运功能来减少细胞Ca2+内流，达到抑制Ca2+超载的目的。

2.5参与细胞增殖

热应激会导致有丝分裂期细胞的纺锤体结构改变，细胞有丝分裂进程被终止，或细胞进行异常分裂。但是，热应激一开始位于星体、纺锤体及中心体等有丝分裂装置的Hsc70就立即释放出来，保证细胞顺利完成有丝分裂。Hsp70在细胞有丝分裂过程中起一定的作用。显微注射Hsp70抗体能推迟热应激后分裂间期中心体结构的恢复和微管的重装配。相反，热应激前注射纯化的Hsp70能促进热应激后分裂间期中心体结构恢复和微管重装配。向鸡胚中加入微量Hsp70抗体，随抗体浓度的增加，可破坏有丝分裂装置，阻断细胞分裂，干扰细胞分化。Hsp70抗体还能降低精子穿过卵母细胞透明带的能力，干扰卵母细胞第二次减数分裂和原核的形成。在应激情况下,Hsp70可作为细胞周期抑制分子的稳定剂或细胞周期促进分子的抑制剂对细胞周期产生负性调控。

综上所述，如果研究者能在哺乳动物早期胚胎发育的某一阶段，实施适当的热应激处理，以诱导胚胎产生高水平的Hsp70，可以增加胚胎对下一次热应激的耐受性，对提高夏季哺乳动物的繁殖性能具有一定的意义。

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The Mechanism of Heat Stress Inhibiting the Mammalian Early Embryonic Development and the Protective Effect of Hsp70

QU Ping-ping，LI Tao，HU Shi-in

(ShandongVocationalCollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Weifang,Shandong, 261061,China)

High temperature in summer is the main reason of the degradation of mammalian reproductive performance. Heat stress inhibits the development of the early embryo by the mechanism of inducing oxidative stress, promoting cell apoptosis and blocking cell mitosis. Hsp70 plays a protective role for embryo through effect of molecular chaperones, inducing thermal tolerance, inhibiting cell apoptosis, resisting oxidative stress and engaging in cell proliferation.

heat stress; mammal; early embryo; Hsp70

2015-03-19修改日期:2015-03-25

山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队建设项目(SDAIT-06-011-05)

屈平平：(1981-)，女，山东菏泽人，讲师，研究方向为动物生殖生理，qupingping0929@163.c.om。

胡士林(1962-)，男，山东诸城人，教授，主要从事牛羊病研究。Email：sdmxhsl@163.com

S823

A

1001-9111(2015)05-0062-04