NLGNs基因在孤独症谱系障碍中的研究进展☆

井绪秀王庆中禹顺英

·综 述·

NLGNs基因在孤独症谱系障碍中的研究进展☆

井绪秀*王庆中*禹顺英**

孤独症谱系障碍 神经连接蛋白 基因变异动物模型

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorders，ASD）是一组起病于婴幼儿时期的神经发育障碍，具有两大核心症状：社交交流与社交互动缺陷；局限的重复性行为模式、兴趣或活动。目前孤独症、Asperger综合征、儿童瓦解性精神障碍以及广泛性发育障碍未特定型4个独立的障碍全部被归为ASD。ASD被认为是一种常见疾病，世界范围内的平均患病率为0.62%[1]。双生子研究显示ASD遗传度约为77%～99%[2]。目前，ASD病因尚不明确，存在诸多病理假说[3]，其中神经突触发育异常假说尤其值得关注。神经连接蛋白（neuroligins，NLGNs）在突触发育和功能活动中具有重要作用，多项研究发现NLGNs基因异常与ASD相关。本综述就NLGNs基因的遗传变异及相关小鼠模型在ASD中的研究进展进行综合概述。

1 神经连接蛋白（NLGNs）概况

NLGNs是一类细胞粘附因子，位于神经元突触后膜，与突触前膜的轴突蛋白（neurexins）相结合，在突触发育和功能中起重要作用，可诱导γ-氨基丁酸（gamma-aminobu⁃tyric acid，GABA）能和谷氨酸能轴突的突触前分化，参与调控兴奋性和抑制性突触之间的平衡。

NLGNs属于I型跨膜蛋白，主要由大的胞外区域(含有1个乙酰胆碱酯酶同源区域、EF手型模体、O糖基化区域）、单次跨膜区域、胞内区域等功能域组成。人类存在5种NLGNs（NLGN-1、-2、-3、-4、-4Y），编码基因及基因染色体位置分别为NLGN1（3q26）、NLGN2（17p13）、NLGN3（Xq13）、NLGN4（Xp22.3）和NLGN4Y（Yq11.2）。NLGN-1只位于兴奋性（谷氨酸能）突触后膜；而NLGN-2主要位于抑制性（GABA能及甘氨酸能）突触后膜上；NLGN-3和NLGN-4则存在于两种类型的突触后膜[4]。NLGN4Y和NLGN4属于同源等位基因，两者在大脑中的表达区域大体相同[5]。

2 NLGNs基因变异在ASD中的研究进展

2.1 NLGNs基因罕见变异与ASDJamain等[5]最先报道NLGNs基因变异与ASD相关。他们在瑞典2个ASD家庭中分别发现X染色体上NLGN3基因的错义突变p.R45lC（这一突变将酯酶区域EF手型模体内一个高度保守的精氨酸残基转变成半胱氨酸）和NLGN4基因的移码突变c.1186insT（突变提前产生了终止密码子，导致蛋白合成在跨膜区域之前终止）。每个家庭有2例患病兄弟，患病兄弟携带相同的突变，突变均遗传于未患病的母亲，其中NLGN4的突变在母亲中首次出现，属于新生突变（de novo mutations），健康对照中未发现上述突变[5]。两个错义突变都导致蛋白质重要结构的改变。

随后，Laumonnier等[6]在法国1个大家系中发现NLGN4基因存在2 bp的缺失突变c.1253delAG，这一突变导致NLGN4基因序列提早出现终止密码子，致使蛋白的跨膜区域和二聚化发生序列不能正常表达，而二聚化形式是与轴突蛋白结合进行细胞间相互作用的必要结构。在这个家系中共13例患者，均为男性，其中有10例非特异性X染色体连锁精神发育迟滞患者，2例孤独症患者，以及1例广泛性发育障碍患者，这些患者均具有上述移码突变。家系中其他男性成员并不携带此缺失突变，女性携带者为杂合突变。在200名健康对照中也未发现上述突变[6]。这种NLGN-4蛋白的缺失可能导致突触结构及功能异常，进而影响语言交流以及认知功能的发展。

Yan等[7]对148例ASD患者和336名健康对照进行NLGN4基因突变筛查，在4例无亲缘关系的ASD患者中发现4个错义突变（p.G99S、p.K378R、p.V403M和p.R704C）。Bemben等[8]研究发现NLGN-4在蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的刺激下T707位点磷酸化，这种磷酸化作用可以显著增强兴奋性突触的传递。但是，错义突变R704C完全消除了T707的磷酸化作用，兴奋性突触的传递受到严重影响。NLGN4基因突变导致翻译后修饰的改变，进而影响突触功能，这种突触兴奋性/抑制性神经传递的失衡，也许正是ASD发生的病理生理基础。

Xu等[9]通过直接测序，在318例中国汉族ASD患者中发现4个罕见的错义突变p.G426S（NLGN3）、p.G84R（NLGN4）、p.Q162K（NLGN4）和p.A283T（NLGN4），4个错义突变均位于NLGNs乙酰胆碱酯酶同源区域，这一区域是与轴突蛋白结合触发突触活动的关键结构。突变分别来自4例无亲缘关系的ASD患者：p.G426S和p.Q162K存在于2例女性患者中，为新生突变；p.G84R和p.A283T存在于2例男性患者中，遗传自未患病母亲。这4个错义突变在453名健康对照中没有发现，千人基因组计划也未报道过[9]。进一步的生物信息学分析显示，p.G84R和p.A283T是潜在的有害突变，这些突变导致突触稳态失衡，使携带者更容易发生ASD[9]。

Yan等[10]对290例孤独症及45例精神发育迟滞患者进行NLGN4Y基因测序，在1例孤独症患者中发现错义突变p.I679V（c.2035A＞G），进一步研究发现其父亲（存在学习障碍）也携带这一突变，研究者对来至不同种族的2986名健康对照进行分析并未发现这一突变。目前已知NLGN4Y上异亮氨酸残基I679是一个高度保守的位点[10]。I679的高度保守性以及健康对照中不存在这一突变都支持p.I679V可能为孤独症的罕见致病原因。

2.2 NLGNs基因拷贝数变异与ASD拷贝数变异（copy number variants，CNVs）作为一种重要的变异是近年ASD分子遗传学研究的热点[11]。NLGNs基因区域的CNVs在ASD研究中也有发现。Glessner等[12]在欧洲人群中对859例孤独症患者和1409名健康对照进行全基因组CNV研究，并在1336例孤独症患者和1110名健康对照中进行验证，发现114例ASD患者的NLGN1基因区域CNV富集（P= 0.0095），但没有对该区域具体的CNV情况进行研究。Levy等[13]在ASD家系研究中发现1例患者的NLGN3基因有33 kb的缺失。

Lawson-Yuen等[14]对1个有多种神经精神疾病的家庭进行研究，发现3例患者NLGN4基因外显子4、5、6缺失。其中1例孤独症男孩伴抽动障碍；其兄长患有Tourette综合征及注意力缺陷多动障碍；母亲为杂合子携带者，有学习能力障碍、焦虑及抑郁症状。该研究表明NLGN4基因突变可能和多种神经精神疾病相关；兄弟2人具有相同的基因变异但表型不同，说明表观遗传在疾病表型中也起到一定作用；母亲为杂合子携带者，具有相对较轻的症状[14]。

关于NLGN4Y基因的拷贝数变异，Hedges等[15]在1例男性孤独症患者以及其未患病父亲和兄弟中发现整个NLGN4Y基因缺失，而在另外2例非亲缘ASD患者中发现NLGN4Y基因的重复。男性性染色体疾病XYY综合征（核型：47，XYY）患者具有较高的ASD患病风险，Ross等[16]假设Y染色体上基因的拷贝数增加导致基因过量表达可能与ASD的发生有关，因此他们对26例XYY患者及11名男性正常对照进行行为量表评估和外周血NLGN4Y表达水平检测。结果发现，XYY患者外周血NLGN4Y表达水平是正常对照的2倍，而且XYY患者NLGN4Y表达水平升高与ASD样行为显著相关。因此，研究者认为NLGN4Y是ASD的易感基因。但这只是一种相关性，NLGN4Y蛋白在脑内神经突触发育中的作用以及NLGN4Y与ASD发生的因果关系有待进一步研究。

2.3 NLGNs基因常见变异与ASD以上的结果都是在ASD患者中发现的一些罕见、有功能改变的基因变异，它们可能在ASD患者中具有重要致病作用。此外，也有研究对NLGNs基因家族的常见变异进行了分析，如Ylisaukko等[17]对芬兰的100个孤独症家系NLGN1、NLGN3、NLGN4和NLNG4Y基因进行分析，发现有3个常见变异——NLGN1（rs1488545）、NLGN3（DXS7132）和NLGN4（DXS996）——在孤独症家庭中存在传递不平衡。Yu等[18]在中国汉族人群中对229例ASD患者和184名健康对照进行NLGN3及NLGN4基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymor⁃phism，SNP）关联分析，发现NLGN3基因的3个SNP位点（rs11795613，rs4844285，rs5981079）与ASD相关。考虑到ASD患病率的性别差异，研究者又进行性别分层分析，发现只有NLGN3基因的1个SNP（rs4844285）及单体型（rs11795613-rs4844285-rs4844286）与男性ASD存在统计学相关[18]。Xu等[9]对318例孤独症儿童进行NLGN3和NLGN4基因关联分析，发现NLGN4基因的2个常见连锁SNP位点rs3747333和rs3747334与中国汉族人群孤独症相关。

虽然有不少研究显示NLGNs基因和ASD相关，但是也有多项研究均未能发现罕见突变或常见变异与ASD之间存在关联[19-21]。在目前研究已发现与ASD相关的NLGNs家族基因变异中，NLGN3和NLGN4的报道最多，而NLGN3和NLGN4都位于X染色体，这也许可以部分解释ASD患病率的性别差异现象。

3 NLGNs动物模型研究进展

动物模型有助于解释基因变异在疾病发生中的作用，目前已经建立多个NLGNs突变小鼠模型以阐明NLGNs基因家族在ASD发生中的作用。目前发现啮齿动物中有4种NLGNs基因（NLGN1、NLGN2、NLGN3、NLGN4）。

3.1 NLGN1小鼠模型Blundell等[22]发现NLGN1基因敲除小鼠表现出孤独症样症状，如社交行为减少、空间学习记忆力下降、重复刻板地梳理毛发行为等。电生理研究显示小鼠大脑海马区长时程增强作用（long-term potentiation，LTP）受损，而LTP与学习记忆的形成密切相关；另外研究者发现，NLGN1基因敲除小鼠皮质纹状体区域突触天冬氨酸受体与氨基羟甲基异恶唑丙酸受体（N-methyl-D-aspar⁃tate receptor/α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepro⁃pionic acid receptor，NMDAR/AMPAR比值）下降，这可能与重复刻板的理毛行为相关，因为给予NMDA受体激动剂后小鼠的重复理毛行为减少[22]。

对NLGN1转基因小鼠行为学研究发现，小鼠学习能力受损，记忆力形成困难，社会互动能力下降[23]。同时，小鼠海马区突触数目明显增加，突触长度、突触联系和树突棘密度也增加，兴奋性突触增多。电生理研究发现，兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）和抑制性突触后电位（inhibitory postsynaptic potential，IPSP）比值（E/I）显著增加，LTP作用受损。这些突触形态和可塑性的损伤都可能导致小鼠学习和记忆能力下降[23]。

3.2 NLGN2小鼠模型Blundell等[24]发现NLGN2基因敲除小鼠有易焦虑、痛觉敏感度下降以及轻微的运动不协调等行为表现。Wöhr等[25]也在NLGN2双敲除小鼠中观察到探索性行为减少，幼年小鼠与母鼠和同伴分离时超声发声减少，同时小鼠还存在发育延迟。Hines等[26]研究发现NLGN2转基因小鼠出现刻板的蹦跳行为、焦虑以及社会交往障碍，并且行为异常的严重程度和NLGN2表达水平相关。以上小鼠模型也都存在脑神经突触形态及电生理方面的异常[25-27]。

3.3 NLGN3小鼠模型NLGN3基因敲除小鼠超声发声交流减少，对新奇事物的偏好降低[28]。考虑到嗅觉在小鼠社会行为中发挥重要作用，研究人员进一步对小鼠进行嗅觉功能的检测，发现小鼠嗅觉功能明显受损。嗅觉的异常可能与小鼠对新鲜事物的兴趣下降有关，而恰恰在一些ASD患者中也存在嗅觉的缺陷[28-29]。

根据在孤独症患者中发现的NLGN3基因R451C点突变，Tabuchi等[30]构建R451C突变小鼠模型，发现模型小鼠社会交往功能受损，而空间学习能力增强，并发现小鼠前脑NLGN-3含量下降90%，躯体感觉皮层抑制性突触传递功能增强，而兴奋性突触传递变化则不明显。但Chadman等[31]在R451C突变小鼠中并未能观察到明显的孤独症样表现，小鼠仅表现出轻微行为异常和刺激敏感性降低。

3.4 NLGN4小鼠模型Jamain等[32]对NLGN4基因敲除小鼠进行研究也发现明显类似于ASD的社会互动和交流方面缺陷，成年小鼠超声发声减少，脑体积也有所减少。Ju等[33]专门针对NLGN4基因敲除幼鼠进行研究，幼鼠超声发声交流显著减少，第一声发声时间延迟，并存在性别差异，雌性小鼠表现更加明显。

NLGNs基因小鼠模型有利于帮助我们理解NLGNs在ASD发生中的机制，虽然目前的研究结果不一致，但几乎所有小鼠模型中都发现兴奋性或抑制性突触神经递质传递异常，也有一些研究发现突触密度和形态改变。NLGN1基因可能主要与记忆力的形成有关，而NLGN2、NLGN3、NLGN4主要涉及社会行为方面功能。NLGNs基因突变小鼠的异常行为表现与孤独症典型症状类似，但是仍需要更细致的行为分析以评估突变小鼠模型的行为和认知表型与ASD的具体关联。

4 展望

综上所述，目前已有多项研究发现NLGNs家族基因的罕见变异和常见变异与ASD相关，虽然也如其它基因组学研究结果一样，有不少研究不能重复这些发现，但还是提示NLGNs家族基因可能参与ASD的发生，至少能解释一部分ASD。NLGNs基因敲除和转基因小鼠研究也显示，无论是NLGNs的缺失还是过度表达，小鼠都可能出现ASD样的行为表现和中枢兴奋性和抑制性网络环路异常。在突触神经递质的传递过程中，NLGNs与突触前膜轴突蛋白、突触后膜的多种骨架蛋白以及神经递质受体、离子通道和信号蛋白紧密相关，协同发挥作用，网络中其它成员的结构功能异常都可能导致突触发育和功能改变，今后对ASD的研究需要更多关注这一网络的结构和功能特征。

目前，ASD尚无很好的治疗方法，部分患者成年后无法独立生活，需要终生照顾和养护，给家庭和患者本身带来极大的负担和痛苦。对于携带NLGNs基因高致病性变异的父母，可以通过筛查降低ASD患儿的出生率。今后更加全面系统地研究ASD发生相关基因变异，尤其是NLGNs及相关通路在突触发育和功能中的作用，有助于明确ASD发生的病理生理基础，为ASD的预防和更加有效的治疗提供理论依据。

[1]Elsabbagh M,Divan G,Koh YJ,et al.Global prevalence of au⁃tism and other pervasive developmental disorders[J].Autism Res, 2012,5(3):160-179.

[2]Colvert E,Tick B,McEwen F,et al.Heritability of autism spec⁃trum disorder in a UK population-based twin sample[J].JAMA psychiatry,2015,72(5):415-423.

[3]王力芳,卢天兰,李俊,等.褪黑素合成酶ASMT基因启动子和第一外显区单核苷酸多态性与儿童孤独症的关联研究[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(3):150-154.

[4]Maćkowiak M,Mordalska P,Wędzony K.Neuroligins,synapse balance and neuropsychiatric disorders[J].Pharmacol Rep,2014, 66(5):830-835.

[5]Jamain S,Quach H,Betancur C,et al.Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism[J].Nature Genet,2003,34(1):27-29.

[6]Laumonnier F,Bonnet-Brilhault F,Gomot M,et al.X-linked mental retardation and autism are associated with a mutation in the NLGN4 Gene,a member of the neuroligin family[J].Am J Hum Genet,2004,74(3):552-557.

[7]Yan J,Oliveira G,Coutinho A,et al.Analysis of the neuroligin 3 and 4 genes in autism and other neuropsychiatric patients[J].Mol Psychiatry,2005,10(4):329-332.

[8]Bemben MA,Nguyen QA,Wang T,et al.Autism-associated mu⁃tation inhibits protein kinase C-mediated neuroligin-4X en⁃hancement of excitatory synapses[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2015,112(8):2551-2556.

[9]Xu X,Xiong Z,Zhang L,et al.Variations analysis of NLGN3 and NLGN4X gene in Chinese autism patients[J].Mol Biol Rep, 2014,41(6):4133-4140.

[10]Yan J,Feng J,Schroer R,et al.Analysis of the neuroligin 4Y gene in patients with autism[J].Psychiatr Genet,2008,18(4): 204-207.

[11]赵雪,张燕霞,禹顺英.孤独症谱系障碍的易感性拷贝数变异研究进展[J].中国神经精神疾病杂志,2014,40(7): 447-448.

[12]Glessner JT,Wang K,Cai G,et al.Autism genome-wide copy number variation reveals ubiquitin and neuronal genes[J].Na⁃ture,2009,459(7246):569-573.

[13]Levy D,Ronemus M,Yamrom B,et al.Rare de novo and trans-mitted copy-number variation in autistic spectrum disor⁃ders[J].Neuron,2011,70(5):886-897.

[14]Lawson-Yuen A,Saldivar JS,Sommer S,et al.Familial deletion within NLGN4 associated with autism and Tourette syndrome[J]. Eur J Hum Genet,2008,16(5):614-618.

[15]Hedges DJ,Hamilton-Nelson KL,Sacharow SJ,et al.Evidence of novel fine-scale structural variation at autism spectrum disor⁃der candidate loci[J].Mol Autism,2012,3(2):1-12.

[16]Ross JL,Tartaglia N,Merry DE,et al.Behavioral phenotypes in males with XYY and possible role of increased NLGN4Y expres⁃sion in autism features[J].Genes Brain Behav,2015,14(2): 137-144.

[17]Ylisaukko-oja T,Rehnström K,Auranen M,et al.Analysis of four neuroligin genes as candidates for autism[J].Eur J Hum Genet,2005,13(12):1285-1292.

[18]Yu J,He X,Yao D,et al.A sex-specific association of common variants of neuroligin genes(NLGN3 and NLGN4X)with autism spectrum disorders in a Chinese Han cohort[J].Behav Brain Funct,2011,7(13):1-10.

[19]Blasi F,Bacchelli E,Pesaresi G,et al.Absence of coding muta⁃tions in the X-linked genes Neuroligin 3 and Neuroligin 4 in in⁃dividuals with autism from the IMGSAC collection[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Gene,2006,141(3):220-221.

[20]Wermter AK,Kamp-Becker I,Strauch K,et al.No evidence for involvement of genetic variants in the X-linked neuroligin genes NLGN3 and NLGN4X in probands with autism spectrum disor⁃der on high functioning level[J].Am J Med Genet B Neuropsychi⁃atr Gene,2008,147(4):535-537.

[21]Liu Y,Du Y,Liu W,et al.Lack of association between NLGN3, NLGN4,SHANK2 and SHANK3 gene variants and autism spec⁃trum disorder in a Chinese population[J].PloS One,2013,8(2): e56639.

[22]Blundell J,Blaiss CA,Etherton MR,et al.Neuroligin-1 deletion results in impaired spatial memory and increased repetitive be⁃havior[J].J Neurosci,2010,30(6):2115-2129.

[23]Dahlhaus R,Hines RM,Eadie BD,et al.Overexpression of the cell adhesion protein neuroligin-1 induces learning deficits and impairs synaptic plasticity by altering the ratio of excitation to in⁃hibition in the hippocampus[J].Hippocampus,2010,20(2): 305-322.

[24]Blundell J,Tabuchi K,Bolliger MF,et al.Increased anxiety-like behavior in mice lacking the inhibitory synapse cell adhesion molecule neuroligin 2[J].Genes Brain Behav,2009,8(1): 114-126.

[25]Wöhr M,Silverman JL,Scattoni ML,et al.Developmental delays and reduced pup ultrasonic vocalizations but normal sociability in mice lacking the postsynaptic cell adhesion protein neuroligin 2[J].Behav Brain Res,2013,251:50-64.

[26]Hines RM,Wu L,Hines DJ,et al.Synaptic imbalance,stereoty⁃pies,and impaired social interactions in mice with altered neurol⁃igin 2 expression[J].J Neurosci,2008,28(24):6055-6067.

[27]Poulopoulos A,Aramuni G,Meyer G,et al.Neuroligin 2 drives postsynaptic assembly at perisomatic inhibitory synapses through gephyrin and collybistin[J].Neuron,2009,63(5):628-642.

[28]Radyushkin K,Hammerschmidt K,Boretius S,et al.Neuroli⁃gin-3-deficient mice:model of a monogenic heritable form of au⁃tism with an olfactory deficit[J].Genes Brain Behav,2009,8(4): 416-425.

[29]沈屹东，董慧茜，赵靖平.孤独谱和障碍患者的嗅觉功能[J].中国神经精神疾病杂志,2015,41(6)：373-376.

[30]Tabuchi K,Blundell J,Etherton MR,et al.A neuroligin-3 muta⁃tion implicated in autism increases inhibitory synaptic transmis⁃sion in mice[J].Science,2007,318(5847):71-76.

[31]Chadman KK,Gong S,Scattoni ML,et al.Minimal aberrant be⁃havioral phenotypes of neuroligin-3 R451C knockin mice[J].Au⁃tism Res,2008,1(3):147-158.

[33]Jamain S,Radyushkin K,Hammerschmidt K,et al.Reduced so⁃cial interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008, 105(5):1710-1715.

[33]Ju A,Hammerschmidt K,Tantra M,et al.Juvenile manifestation of ultrasound communication deficits in the neuroligin-4 null mu⁃tant mouse model of autism[J].Behav Brain Res,2014,270: 159-164.

R749.94(

2014-11-17）

A（责任编辑:肖雅妮）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.07.015

☆ 上海市重性精神病重点实验室项目（编号：13dz2260500）

* 上海交通大学医学院附属精神卫生中心（上海 200030）

**上海交通大学医学院附属精神卫生中心遗传学研究室