Myocardin相关转录因子 -A对缺氧缺血诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

钟泽 胡家庆 胡新央 蒋峻 吴新东 相鹏

Myocardin相关转录因子 -A
对缺氧缺血诱导的大鼠心肌细
胞凋亡的影响

钟泽 胡家庆 胡新央 蒋峻 吴新东 相鹏

目的 研究Myocardin相关转录因子-A（MRTF-A）对缺氧缺血诱导的心肌细胞凋亡的影响及机制。方法 20只大鼠采用随机数字表分为假手术组和缺血再灌注组。假手术组大鼠实行开胸手术但不构建缺血再灌注模型，缺血再灌注组结扎冠状动脉30min再松开2h建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，免疫组化法检测MRTF-A表达；体外培养大鼠原代心肌细胞，转染MRTF-A及小分子mRNA表达质粒并构建缺氧缺血模型。通过流式细胞术检测细胞凋亡率，以Western blot法分析凋亡相关基因bcl-2蛋白表达；采用荧光素酶检测bcl-2转录活性。结果 假手术组和缺血再灌注组的心肌凋亡细胞分别为（8.14±2.33）%和（82.35±7.93）%，缺血再灌注组高于假手术组（P＜0.05）。假手术组有少量MRTF-A蛋白表达，缺血再灌注组胞浆中有大量MRTF-A蛋白表达。在体外培养的原代心肌细胞中，对照组、模型组、MRTF-A处理组与MRTF-A抑制组的凋亡率分别为（4.63+2.33）%、（79.97+9.09）%、（43.63+3.52）%和（72.16+5.37）%；bcl-2的蛋白表达分别为0.313+0.014、0.186+0.019、0.254+0.013与0.175+0.017。模型组凋亡率高于对照组（P＜0.01），MRTF-A处理组的凋亡率低于模型组（P＜0.01）；MRTF-A抑制组的凋亡率高于MRTF-A处理组（P＜0.05）；模型组bcl-2的蛋白低于对照组（P＜0.01），MRTF-A处理组的bcl-2的蛋白高于模型组（P＜0.01）；MRTF-A抑制组的bcl-2的蛋白低于MRTF-A处理组（P＜0.05）；MRTF-A对bcl-2的转录活性的调控与对照组相比明显升高（P＜0.01），而MRTF-A对突变后的bcl-2的转录活性与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 缺血再灌注损伤诱导了大鼠心肌细胞凋亡，上调了心肌组织中MRTF-A的蛋白表达；MRTF-A通过上调bcl-2的转录活性表达起到对缺氧缺血诱导的大鼠原代心肌细胞凋亡损伤的保护作用。

Myocardin相关转录因子-A 缺血再灌注 心肌凋亡

【 Abstract】 Objective To observe the effect of myocardial myocardin-related transcription factor-A (MRTF-A)on myocardium apoptosis and its mechanism. Methods 20 rats were randomly divided into sham and ischemia-reperfusion(myocardial ischemia30-min and reperfusion 2h)group (n=10 each).TUNEL was used to detect cardiomyocyte apoptosis,the MRTF-A expression was detected by immunohistochemistry.One day neonatal rat ventrical was used as cell culture and hypoxia-no glucose damaged myocardial cell before over-expression of wild-type MRTF-A or siRNA in myocardial cell.The apoptosis rate was measured by FCM.The bcl-2 expression was analyzed by western blot.The bcl-2 transcriptional activity was detected by luciferase. Results The number of apoptotic cardiomyocytes in the sham group and ischemia-reperfusion group were (8.14± 2.33）%and(82.35±7.93)%,respectively(P＜0.05).The protein expression of MRTF-A in the sham group were significantly lower than those in ischemia-reperfusion group.In cultured neonatal rat cardiomyocyte,the apoptotic of control group,model group, MRTF-A transfection group and siRNA transfection group were (4.63+2.33)%、(79.97+9.09)%、(43.63+3.52)%、(72.16+5.37)%；The protein expression of bcl-2 were 0.313+0.014、0.186+0.019、0.254+0.013、0.175+0.017.Over-expression of wild-type MRTF-A upregulated the transcription activity of bcl-2 reporter gene,but the mutation bcl-2 reporter gene. Conclusion The expression of MRTF-A had changed that induced by ischemia-reperfusion.MRTF-A promoting myocardial survival against apoptosis induced by hypoxia-no glucose via up-regulation bcl-2 transcription activity.

【Key words】 Mocardial myocardin-related transcription factor-A Ischemia-reperfusion Myocardial apoptosis

血液供应阻断30min以上即可导致心肌细胞不可逆的损伤甚至死亡，及时恢复血供被视为挽救部分心肌细胞功能的重要措施[1-2]。然而，心肌得到血液再灌注后，不仅功能未得到恢复，反而使心肌损伤加重，出现心率失常、梗死面积扩大等病变[3-4]。SAP蛋白家族的Myocardin相关转录因子MRTF-A均由807个氨基酸残基组成[5-7]，其表达较广泛，参与心肌的基因转录调控。研究发现，在心肌细胞中，表达野生型MRTF-A能够诱导心肌肥大及新生鼠原代心肌细胞的血管发育相关基因表达。另有文献报道，在心肌梗死时MRTF-A可调控成纤维细胞的活性和纤维症。因此，MRTF-A对心肌细胞的发育、生长、凋亡发挥重要作用。但MRTF-A对CArG box依赖基因转录调控的机制尚未阐明。为此，本研究拟在体大鼠心肌缺血再灌注时观察MRTFA表达，同时检测在体外低氧诱导的心肌细胞凋亡时，MRTF-A对细胞凋亡的影响及对靶基因即抗心肌细胞凋亡的基因（bcl-2）表达的调控，初步探讨MRTF-A对大鼠缺氧缺血诱导的心肌细胞凋亡的影响的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料及仪器 健康成年SD雄性大鼠20只,购自中国科学院上海实验动物中心，清洁级，体重270～310g。野生型MRTF-A表达质粒、小分子mRNA表达质粒及bcl-2报告基因质粒由上海生工生物公司构建。抗体MRTF-A和bcl-2由美国Santa Cruz公司提供。转染试剂购自瑞士Roche公司。凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司。免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。HX-300动物呼吸机购自中国成都泰盟科技有限公司。垂直电泳、电转槽、电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司。流式细胞仪为美国BD产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 采用随机数字表法分为两组：假手术组，缺血再灌注组，每组10只。缺血再灌注组：以10%水合氯醛于大鼠腹腔注射进行麻醉，对大鼠行气管切开，动物呼吸机辅助大鼠呼吸，呼吸频率60次/min，潮气量18ml/kg，于大鼠四肢皮下插入针形电极，记录心电图，沿大鼠胸骨左缘第2、3、4肋间行纵向切口开胸，破开胸膜及心包膜，暴露心脏。于大鼠心脏左冠状动脉前降支起始部，用6-0号医用缝合丝线穿过心肌浅表层，稳定30s，将丝线两端同时穿入一直径1mm，长2cm的塑管，将塑管垂直压向大鼠心脏，勒紧丝线，阻断大鼠左冠状动脉前降支血流，达到结扎目的，造成心肌缺血。以心脏局部缺血，发绀，心电图ST段抬高为缺血成功。缺血30min后，松开塑管，恢复灌注，灌注2h。假手术组：仅暴露心脏，不做心肌缺血再灌注处理。

1.2.2 原位末端（TUNEL）法检测细胞凋亡 取大鼠正常及缺血再灌注的组织，依次进行10%中性缓冲甲醛固定、石蜡包埋、切片。将组织石蜡切片经脱蜡水化后，用0.1% Triton X-100和0.1%柠檬酸钠溶液通透，将通透好的切片用PBS漂洗沥干，用血清封闭30 min，PBS漂洗3次，按照比例加入末端标记酶和标记液配置成的TUNEL反应工作液，放入湿盒避光30℃，孵育1 h，将处理好的组织用甘油封片。细胞核染色呈棕黄色或棕红色定义为细胞染色阳性，在Olympus-CH光学显微镜下计算10个高倍镜视野，阳性细胞除以总细胞数计算平均阳性率（%）。

1.2.3 免疫组化检测MRTF-A表达 取大鼠正常及缺血再灌注的组织，依次进行10%中性缓冲甲醛固定、石蜡包埋、切片。将切片浸入0.01 mol/L（pH 6.0）柠檬酸盐缓冲液中，于微波炉中加热至100℃、持续5min，反复2次。室温自然冷却后，用0.1mol/L PBS洗涤5min×2次。滴加封闭液羊血清置室温20min，甩去多余的液体。滴加1∶50抗体，阴性对照以PBS代替1抗，于4℃孵育过夜，以0.1mol/L PBS洗涤5min×3次。滴加生物素标记2抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗5min×2次。使用DAB显色试剂盒，室温显色，镜下控制反应时间，自来水冲洗。滴加苏木素轻度复染后，依次进行脱水、透明、中性胶封片及显微镜观察。

1.2.4 原代心肌细胞培养及分组 取新生1d的SD乳鼠（雌雄均可），在无菌条件下取其心室肌剪碎，经0.1%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心收集后，用含10%小牛血清的DMEM培养基制成浓度为5×105/ml细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。将培养的细胞分为4组：对照组（将培养的心肌细胞转染pGL3空载体）、模型组（将培养的心肌细胞转染pGL3空载体36h后，再行缺血缺氧处理）、MRTF-A处理组（将MRTF-A表达质粒转染入心肌细胞36h后，再行缺血缺氧处理）、MRTF-A抑制组（将MRTF-A及MRTF-A小分子mRNA表达质粒转染入心肌细胞36h后，再行缺血缺氧处理）。

1.2.5 心肌细胞缺血缺氧处理 将培养3d同步搏动的心肌细胞换用高纯氮气饱和的无血清DMEM培养基，并于培养瓶内充氮气1min，将瓶内空气置换出。放置于37℃恒温培养箱密闭培养，造成心肌细胞缺血缺氧损伤。于12h后行流式细胞术或Western blot法检测指标。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节密度为1×108/L接种于12孔板中，每孔2ml，经前期处理后，用细胞凋亡检测试剂盒内的缓冲液300L重悬，加入5μlannexin V-FITC混匀后，加入5μl碘化丙啶混匀室温避光反应10min，最后在1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7 Western bloting检测bcl-2表达 取大鼠心脏缺血部位的组织加入裂解液匀浆，12 000r/min离心5min，取上清液测蛋白浓度。将上清液与6×loading buffer混合后，沸水浴加热5min，离心取上清液。于4℃凝胶电泳，电转移1h至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉溶液4℃封闭过夜，加入1抗体室温孵育2h，TTBS洗膜3× 10min，加入HRP标记的2抗，室温孵育膜2h，TTBS洗膜4×15min。曝光底片，扫描保存为电脑文件，用Quantity One 4.62软件将条带的灰度值数字化。以actin作内参照，目的条带与其相比得到相对量。

1.2.8 bcl-2转录活性检测 在1.2.4中实验分组的基础上，细胞处理后，吸弃培养基，用冰PBS冲洗2次，加入1×细胞裂解液100 μl放置于摇床室温振荡15 min，确保细胞与裂解液充分接触直至完全溶解。将双荧光素酶报告基因检测试剂盒中的荧光素酶检测缓冲液和荧光素酶底物混合均匀后，加入到细胞溶解液中。即刻上机检测荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用LSD-t检验。相关性分析采用Pearson直线相关分析法。

2 结果

2.1 缺血再灌注损伤对心肌细胞凋亡的影响 见插页图1。

由图1可见，假手术组心肌细胞形态正常，规则界限清晰，细胞核着色为浅黄，TUNEL阳性反应细胞（即凋亡细胞）较少，凋亡细胞为（8.14±2.33）%；心肌缺血30min再灌注2h心肌组织中可见较多TUNEL阳性反应细胞，凋亡细胞主要呈现为深棕色，凋亡细胞为（82.35±7.93）%，缺血再灌注组高于假手术组（P＜0.05）。

2.2 缺血再灌注损伤对心肌组织中MRTF-A表达的影响 见插页图2。

由图2可见，MRTF-A蛋白表达的阳性部位主要在胞浆中，在高倍镜下可见胞浆内有棕黄色的小颗粒。在假手术组心肌组织中，胞浆内可见少量阳性染色区域；缺血再灌注组有大量胞浆染色呈棕黄色，MRTF-A蛋白表达为强阳性。

2.3 MRTF-A对缺氧缺血诱导的原代心肌细胞凋亡的影响 见图3。

由图3可见，对照组凋亡率（4.63+2.33）%，模型组（79.97+9.09）%，MRTF-A处理组（43.63+3.52）%，MRTF-A抑制组（72.16+5.37）%。与对照组相比，模型组凋亡率明显升高（P＜0.01），而MRTF-A处理组的凋亡率较模型组明显降低（P＜0.01），同时，MRTF-A抑制组的凋亡率较MRTF-A处理组升高（P＜0.05），而与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 MRTF-A对抗凋亡基因bcl-2蛋白表达及转录活性的影响 见图4。

由图4A、B可见，模型组bcl-2表达量0.186+ 0.019，较对照组（0.313+0.014）降低（P＜0.01）；与模型组相比，MRTF-A处理组bcl-2表达量（0.254+0.013）增加（P＜0.05）；另外，MRTF-A抑制组bcl-2表达量0.175+0.017，较MRTF-A处理组下降（P＜0.05），而与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。由图4C可见，模型组与对照组对比，bcl-2转录活性差异无统计学意义（P＞0.05）；MRTF-A处理组bcl-2转录活性与模型组比较明显上调（P＜0.01）；但MRTF-A抑制组的 bcl-2转录活性较MRTF-A处理组显著下降（P＜0.01），较模型组升高（P＜0.01）。

3 讨论

心肌缺血性坏死而导致的心肌梗死是引起患者猝死的主要心血管疾病，在我国呈逐年上升的态势，严重威胁人们健康及生命安全。目前，心肌梗死诱导心室重构及后期细胞凋亡被认为是主要的机制之一，心肌细胞凋亡程序如何启动、在疾病发生、发展及治疗过程中又如何调控尚未研究明确。目前临床治疗主要是促进缺血心肌再灌注，虽然再灌注可以改善心肌的血液供应，但也会加重心肌缺血所造成的损伤，导致心肌梗死面积扩大，细胞炎症反应，再灌性心律失常等，影响患者的预后。

MRTF-A在Myocardin介导的心肌等平滑肌细胞生长、发育、存活、增殖或凋亡功能中发挥重要作用。业已证明，心肌梗死激活Rho信号途径，引起胞质内G-肌动蛋白池的减少，使G-肌动蛋白从MRTF-A上解离下来，促进MRTF-A向细胞核转移，与SRF结合共同调控SRF依赖的基因转录，在Myocardin介导的。上述研究资料提示，MRTF-A在Myocardin介导的心肌细胞的生长、发育及凋亡过程中有重要作用。因此，深入研究MRTF-A在心肌缺血发病过程中的作用，不仅有助于进一步揭示其作用机制，同时也可为临床治疗提供科学依据。

细胞凋亡的变化具有形态学特征性，荧光标记的TdT介导dUTP缺口末端标记（TUNEL）法观察凋亡细胞核被认为是定性检测细胞凋亡的经典方法，它具有敏感度高、特异度强、可量化凋亡程度的特点。本研究结果显示，在缺血区心肌组织中可见较多TUNEL阳性反应细胞，与假手术组比较,TUNEL阳性细胞明显增多。此结果说明，大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型构建成功。在此基础上，运用免疫组化法检测缺血再灌注损伤区域的MRTF-A蛋白表达，结果发现在假手术组的心肌组织中，胞浆内可见少量阳性染色区域。在缺血再灌注模型组，有大量胞浆染色呈棕黄色，MRTF-A蛋白表达为强阳性。提示MRTF-A可能参与了心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡的过程。那么，MRTF-A作为转录调节因子是是否能影响缺血缺氧所诱导的原代心肌细胞凋亡，其机制如何？

bc1-2家族是细胞凋亡重要的调控蛋白，包括凋亡抑制蛋白bc1-2、促凋亡蛋白Bax及含BH3的结构域蛋白。其中，bc1-2主要定位于线粒体膜及内质网膜，保护膜的稳定性，抑制细胞色素C释放，使其无法达到激活凋亡关键蛋白酶Caspase的阈值，阻止细胞凋亡。本研究首先在体外培养的原代心肌细胞上，转染MRTF-A表达质粒或共转染MRTF-A和MRTF-A siRNA，用缺氧缺血诱导细胞凋亡，用FCM法观察MRTF-A对缺氧缺血诱导细胞凋亡的影响。结果表明，缺氧缺血能明显诱导原代心肌细胞凋亡，而转染MRTF-A表达质粒，即当细胞过表达MRTF-A时，能明显抑制缺氧缺血诱导的原代心肌细胞的凋亡，而MRTF-A siRNA能逆转该效应。该结果表明，转录调节因子MRTF-A能明显抑制缺氧缺血诱导的原代心肌细胞的凋亡。

以此同时，在原代心肌细胞上，转染MRTF-A表达质粒或共转染MRTF-A和MRTF-A siRNA质粒，用缺氧缺血处理细胞，诱导其凋亡，观察在缺氧缺血诱导的原代心肌细胞凋亡过程中，MRTF-A对bc1-2表达的影响。结果发现：在缺氧缺血诱导的原代心肌细胞凋亡的过程中，转染MRTF-A表达质粒能明显上调bc1-2的表达，与其对细胞凋亡的抑制作用呈现相关性。那么MRTF-A是否可影响bc1-2的转录活性？为此，本研究构建了启动子含的bc1-2报告基因质粒及其突变体质粒并转染至原代心肌细胞，观察MRTF-A对bc1-2转录活性的影响。结果显示，转染MRTF-A表达质粒能明显上调bcl-2报告基因的转录活性，而报告基因启动子突变后，则转染MRTF-A表达质粒对其转录活性无明显影响。

综上所述，在缺血再灌注大鼠心肌损伤模型上，发现在缺血再灌注损伤时，缺血区组织中MRTF-A的表达明显升高，推测MRTF-A可能参与了心肌缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡；在体外培养的原代心肌细胞上，发现转录调节因子MRTF-A能抑制经缺氧缺血诱导的细胞凋亡，其调节作用可通过上调抗细胞凋亡相关靶基因bc1-2的表达实现，且初步证明其作用部位为靶基因启动子上的CArG box。

[1]Moens A L,Claeys M J.Myocardial ischemia/reperfusion-injury, a clinical view on a complex pathophysiological process[J].International Journal of Cardiology,2005,100:179-190.

[2]杨锐，王芬珍.在体大鼠心肌缺血再灌注损伤中NF-κBp65与AngⅡ表达的变化[J].心电与循环,2014,33(2):123-126.

[3]Braunwald E,Kloner RA.Myocardialreperfusion:a double-edged sword[J].Clin Invest,1985,76(5):1713-1719.

[4]Yellon D M,Baxter G F.Protecting the ischaemic and reperfused myocardium in acute myocardial infarction:distant dream or near reality[J].Heart,2000,83(4):381-387.

[5]Rickhag M,Teilum M,Wieloch T.Rapid and long-term induction of effector immediate early genes(BDNF,Neuritin and ARC) in peri-infarct cortex and dentate gyrus after ischemic injury in rat brain[J].Brain Res,2007,1151:203-210.

[6]Joseph M.Miano.Serum response factor:toggling between disparate programs of gene expression[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2003,35:577-593.

[7]Messenguy F,Dubois E.Role of MADS box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development[J].Gene,2003,316:1-21.

（本文编辑：马雯娜）

《浙江医学》对计量单位的要求

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Protection effect of Myocardin-related transcription factor-A on myocardial survival via inhibiting apoptosis

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