活性菌肽豆蛋白喷雾干燥工艺研究

■ 谢帝芝 陈 芳 刘 臻 聂国兴 鲁双庆

(1.河南师范大学水产学院，河南新乡453007；2.长沙学院生物工程与环境科学系，湖南长沙410003)

青鱼生长激素（black carp growth hormone,bc⁃GH）能促进鱼体生长发育，加速蛋白质的合成，促进脂类降解等。酵母不仅是水产饵料中较为理想的蛋白源，而且还是外源基因理想表达受体系统，表达蛋白可以正确折叠、糖基化，具有活性等。近年来，本实验室成功构建了青鱼生长激素基因工程酵母菌（简称，工程酵母菌）。并以豆粕为发酵底物，用该菌进行液态发酵，以甲醇做基因表达的诱导剂，研究了工程酵母菌在豆粕中的发酵工艺。工程酵母菌的发酵产物中既含有促生长的bcGH蛋白，又含有豆粕降解的肽类物质，人们将这种的发酵豆粕称为活性菌肽豆蛋白。本研究室利用活性菌肽豆蛋白配合饲料饲喂鲫,结果表明活性菌肽豆蛋白具有显著的促生长效果。上述研究为活性菌肽豆蛋白作为一种新型蛋白饲料，广泛地应用到水产配合饲料中奠定了基础。

为了能使工程酵母菌发酵产物——活性菌肽豆蛋白产业化，需将其干燥浓缩化。然而，同大多数微生物一样，工程酵母菌也具有热敏性和湿敏性，干燥过程需要改变物料的温度和湿度。喷雾干燥是一种生产率高、干燥时间短，操作工程简单且费用低的工艺，是最普遍采用的浓缩微生物的方法之一。所以，本研究拟采用喷雾干燥法浓缩活性菌肽豆蛋白，探讨干燥工艺参数对浓缩活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率的影响，为工业化生产活性菌肽豆蛋白提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与培养基

菌种：工程酵母菌为本实验室构建保存。

菌种活化培养基（MD培养基）：15 g/l琼脂粉，高压灭菌20 min，再加入过滤除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、20 g/l葡萄糖和0.4 mg/l生物素；种子培养基（BMGY培养基）：20 g/l胰蛋白胨，10 g/l酵母粉，高压灭菌20 min，再加入过滤除菌的13.4 g/l酵母基本氮源、pH值6.0 100 mM磷酸钾、1%甘油和0.4 mg/l生物素；发酵培养基：6%豆粕粉；检测培养基（YPD培养基）：10 g/l酵母提取物，20 g/l胰蛋白胨，20 g/l琼脂粉，高压灭菌20 min,再加入过滤除菌的20 g/l葡萄糖。

1.1.2 仪器与设备

INFORS AGCH-4103控温摇床；TOMYSS-325灭菌锅；Thermo Forma超净工作台；BECKMAN Avanti J-30I离心机；SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度计；数显生化培养箱；SY3000发酵罐；YC-015实验型喷雾干燥机。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养

①菌种活化：取-80℃冰箱保藏的工程酵母菌菌种划线转接到MD培养基，30℃恒温倒置培养72 h。

②种子培养：接1环生长良好的MD平板种子至50 ml种子培养基的500 ml摇瓶中，置于300 r/min恒温摇床，30 ℃振荡培养24 h，当菌液A560为2～6时，作为发酵用种子。

③种子浓度的测定：采用紫外可见分光光度计测定种子的光密度。以种子培养基作空白对照，取1 ml种子液于1 cm比色皿中，560 nm波长下测定OD值。

1.2.2 发酵罐发酵

使用火焰接种法接种工程酵母菌，将培养好的种子接入装填量为7 L的10 L发酵罐。具体发酵工艺见作者前期研究工作[7]。发酵完毕后，取100 ml样本用于检测其含菌量。

1.2.3 喷雾干燥

用YC-015实验型喷雾干燥机干燥1 L工程酵母菌发酵液，气体经过鼓风机后被过滤并分别加热到相应的温度，以一定的速度进风，蠕动泵将发酵液分别以应的速度传送到双流不锈钢喷雾器。排出气体温度通过调控发酵液进样速度而控制在60℃左右。从旋风分离器下收集发酵产品——活性菌肽豆蛋白（约100 g），取1 g样本用于检测其含菌量。

1.2.4 工程酵母菌计数及存活率计算

取0.1 ml工程酵母菌发酵液或0.1 g活性菌肽豆蛋白粉末溶于9.9 ml中，用无菌水逐级稀释104倍，再取0.1 ml稀释液均匀涂布于YPD平板上，30 ℃，倒置培养72 h，计数每个平板上的工程酵母菌菌落数，同时做三个平行。

式中:A为每ml液含菌量；B为每g活性菌肽豆蛋白粉末含菌量；X为0.1 ml稀释液含菌量；C为工程酵母菌存活率。

1.3 数据统计

结果以每个处理3个平行的“平均值±标准误（Mean±SE）”表示。

2 结果与分析

2.1 工程酵母菌发酵液含菌量

工程酵母菌发酵液通过稀释、倒置培养和计数，测得每1 L发酵液平均含菌量高达7.96×109CFU/ml。

2.2 进风温度对工程酵母菌存活率的影响

为摸索最适的进风温度，将进风速度和进样速度分别固定为在1.10 m3/min和12.00 ml/min，研究不同进风温度对工程酵母菌存活率的影响（见表1）。结果表明，工程酵母菌存活率随着进风温度的升高呈现先增加后降低的趋势。当进风温度为120℃时，活菌数高达2.09×1010CFU/g，存活率最高。进风温度越高，表面水分蒸发得越快，水分蒸发虽是瞬间，但过高的温度也会导致工程酵母菌大量死亡；进风温度太低，工程酵母菌发酵产品会因含水量高而严重粘壁，影响产品收集和菌的存活率。

表1 进风温度对bcGH工程菌存活率的影响

2.3 进风速度对工程酵母菌存活率的影响

探讨了进风速度对工程酵母菌存活率的影响，在进风速度达到1.10 m3/min之前，活菌数和存活率与进风速度成正比例，而当进风速度超过1.10 m3/min时，工程酵母菌存活率明显下降，其结果如表2。进风速度太快，产品不能完全干燥，而且随废气一起排出，降低了工程菌存活率；速度过慢，也会因严重粘壁而影响菌的存活率。

表2 进风速度对工程酵母菌存活率的影响

2.4 进样速度对工程酵母菌存活率的影响

表3 进样速度对工程酵母菌存活率的影响

由表3可以看出，当进样速度为14.00 ml/min时，工程酵母菌存活率有所下降，而进样速度为12.00 ml/min时，工程酵母菌存活率最高。结果提示活菌数和存活率并不是随着进样速度的增加而一直提高，这是因为单位时间内供热量不变，进样速度越大，干燥效率就越低，造成严重的粘壁现象，影响产品的收集和菌存活率；进样速度太低，单位物料承受的热量过大，蒸发过度，使菌体大量死亡。

2.5 喷雾干燥正交试验

通过单因素试验大致确定了喷雾干燥的条件，为了使获得的工程酵母菌存活率达到最大，选用进风温度、进风速度、进样速度3个因素，采用3因素4水平正设计方法进行喷雾干燥条件的优选试验，因素水表与正交设计及试验结果分别见表4和表5。

表4 喷雾干燥正交试验因素水平

根据表5所示计算结果，比较各因素极差R值大小，可以看出各因素对工程酵母菌存活率的影响主次顺序：进风温度＞进样速度＞进风速度，最优干燥组合条件为A3B2C3，即进风温度120℃，进风速度1.10 m3/min，进样速度12.00 ml/min。

表5 喷雾干燥正交试验结果

2.6 喷雾干燥正交试验验证试验

将正交试验得到的最佳喷雾干燥条件组合与理论最佳组合（10号）进行比较，每个组合重复3次，确定最佳组合。

表6 酵母工程菌存活率正交试验验证结果

表6的数据说明，通过正交试验所获得最佳喷雾干燥工艺条件，重复性很好，工程酵母菌平均存活率为28.54%，平均值比10号（A3B2C4）的试验结果高出5个百分点，说明优化条件具有很好大的重现性和可靠性。

3 讨论

为了使活性菌肽豆蛋白中工程酵母菌存活率最大化，本文正交实验探讨了喷雾干燥的进风温度、进风速度、进样速度等3个因素对工程酵母菌存活率的影响。研究结果表明，进风温度对工程酵母菌的存活率影响最大，为主要影响因素。在其它微生物的喷雾干燥研究中，也发现进风温度显著影响了菌体存活率。例如，张煜等研究表明当进风温度高于170℃，活性乳酸菌豆粉中的乳酸菌存活量明显降低。在植物乳杆菌MA2喷雾干燥过程中，发现140℃进风温度下得到的发酵剂活菌数最高，达到7.3×108CFU/g，当进口温度达到200℃时，活菌数降低到2.7×107CFU/g。本研究也发现130℃进风温度下工程酵母菌存活率低于120℃近4个百分点。Teixeira等[13]研究发现喷雾干燥温度对微生物的致死作用主要是由于菌体蛋白质凝固变性，核酸发生降解变性失活，从而破坏细胞的组成；热溶解细胞膜上类脂质成分形成极小的孔，使细胞内容物流失，从而导致死亡。虽然喷雾干燥影响微生物的存活率，但是相对冷冻浓缩干燥法来说，其产业化利用的价值更大，前景更广。

4 结论

活性菌肽豆蛋白的最适宜干燥工艺条件为：进风温度为120℃、进风速度为1.10 m3/min，进样速度为12.00 ml/min下，在此组合条件下活性菌肽豆蛋白中的工程酵母菌活菌数高达2.10×1010CFU/g，存活率为28.54%。本试验验证了喷雾干燥方法对活性菌肽豆蛋白干燥是完全可行的，为工业化生产活性菌肽豆蛋白的新型微生态饲料添加剂提供试验依据。

（参考文献13篇，刊略，需者可函索）