三叉苦叶中三个黄酮类化合物的体外抗炎活性研究

□ 魏荷琳 曾邦国 肖隆祥 宋成英 伍朝君

炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的防御反应，典型的反应是出现红、肿、热、痛和功能障碍等临床症状，是机体对内外环境中有害刺激所产生的一种复杂的生理和病理反应［1］。近代药理学研究表明炎症与人体感染、心脑血管病、肿瘤、神经退行性疾病、变态反应等许多重大疾病的发生和发展过程相关。

三叉苦为芸香科吴茱萸属植物三桠苦(Euodia lepta(Spreng.)Merr.)的茎及带叶嫩枝，又名三叉虎、三丫苦等。三叉苦性寒，味苦，有清热解毒、祛风除湿的功效，主治咽喉肿痛、黄疸型肝炎、湿疹、皮炎等［2］。《南宁市药物志》记载其有清热解毒、舒筋活络、祛风湿、止痒的功效;《岭南采药录》记载其可清热毒，治跌打损伤、疮疡、疟疾;《广州部队常用中草药手册》记载其有清热解毒、燥湿止痒的功效，可防治流感、流脑、乙型脑炎，治疗扁桃体炎、咽喉炎、湿疹、皮炎、痔疮等。三叉苦作为岭南地区传统应用的一种地方中草药，是目前市售很多成方制剂中的主要药味，如999感冒灵颗粒、三九胃泰、三金感冒片等。但关于三叉苦的现代药理研究十分薄弱，对于其发挥药效的活性成分尚未阐明。因文献所记载的三叉苦药用功效大多和炎症有关，所以为了寻找三叉苦中的抗炎活性成分，本文在研究三叉苦叶的化学成分基础上，将分离得到的三个黄酮类化合物 pteleifolosin C、3，5，3＇-trihydroxy-8，4-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enyloxy)flavone和 3，5，4＇-trihydroxy-8，3＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enoxy)flavone，以LPS诱导的 BV-2细胞对三个化合物进行了抗炎活性体外筛选，结果表明三个化合物均有较好的抗炎活性。

一、实验部分

(一)细胞及试剂。BV-2细胞(由北京协和医科大学提供)，实验用细胞处于对数生长期;DMEM培养基(Hyclone，美国);胎牛血清(FBS，Hyclone，美国);NO化学法试剂盒(南京建成生物公司);阳性对照用槲皮素(Sigma，美国);细菌脂多糖(LPS，Sigma，美国)。

Griess试剂A:0.1%N-萘乙二胺盐酸盐;Griess试剂B:5%H3PO4含1%对氨基苯磺酸酰胺。

(二)实验样品及配制方法。实验用三个黄酮类化合物为本实验室自制。化合物信息如表1。

表1 化合物信息表

化合物结构鉴定过程如下。

化合物1:黄色固体;HCl-Mg粉反应阳性;香草醛-硫酸喷雾显黄色斑点;EI-MS:m/z 384［M］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.43(1H，s，5-OH)，7.71(1H，d，J=2.0 Hz，H-2＇)，7.68(1H，dd，J=2.0，9.0 Hz，H-6＇)，7.01(1H，d，J=9.0 Hz，H-5＇)，6.72(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.34(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.46(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.65(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，4＇-OCH3)，1.76(3H，s，H-4＇＇)，1.73(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:175.7(C-4)，163.8(C-7)，159.9(C-5)，155.7(C-9)，149.1(C-4＇)，146.4(C-3＇)，145.8(C-5)，137.8(C-3＇＇)，136.0(C-3)，123.0(C-1＇)，119.4(C-6＇)，118.7(C-2＇＇)，114.4(C-2＇)，111.4(C-5＇)，103.6(C-10)，97.6(C-6)，92.2(C-8)，64.9(C-1＇＇)，55.3(4＇-OCH3)，25.0(C-4＇＇)，17.7(C-5＇＇)。

以上数据与文献［3］对照一致，确定该化合物为pteleifolosin C。

化合物2:黄色固体;HCl-Mg粉反应阳性;香草醛-硫酸喷雾显黄色斑点;ESI-MS:m/z 413［M-H］-;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，9.55(1H，s，3-OH)，9.41(1H，s，3＇-OH)，7.72(1H，d，J=1.5 Hz，H-2＇)，7.70(1H，dd，J=1.5，8.0 Hz，H-6＇)，7.12(1H，d，J=8.0 Hz，H-5＇)，6.58(1H，S，H-6)，5.48(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，4＇-OCH3)，3.82(3H，s，8-OCH3)，1.77(3H，s，H-4＇＇)，1.74(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:176.3(C-4)，157.0(C-7)，155.6(C-5)，149.5(C-3＇)，147.7(C-9)，146.7(C-3＇)，146.3(C-2)，138.3(C-3＇＇)，136.1(C-3)，128.5(C-8)，123.5(C-1＇)，119.8(C-6＇)，119.1(C-2＇＇)，114.5(C-5＇)，111.9(C-2＇)，103.4(C-10)，96.2(C-6)，65.7(C-1＇＇)，60.9(8-OCH3)，55.6(4＇-OCH3)，25.4(C-4＇＇)，18.1(C-5＇＇)。以上数据与文献［4］对照一致，确定该化合物为3，5，3＇-trihydroxy-8，4＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enyloxy)flavone。

化合物3:黄色粉末;EI-MS:m/z 414［M］+;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:12.23(1H，s，5-OH)，9.79(1H，s，4＇-OH)，9.54(1H，s，3-OH)，7.78(1H，d，J=2.0 Hz，H-2＇)，7.73(1H，dd，J=2.0，8.5 Hz，H-6＇)，6.98(1H，d，J=8.5 Hz，H-5＇)，6.58(1H，S，H-6)，5.47(1H，t，J=6.5 Hz，H-2＇＇)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-1＇＇)，3.85(3H，s，3＇-OCH3)，3.83(3H，s，8-OCH3)，1.77(3H，s，H-4＇＇)，1.74(3H，s，H-5＇＇);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:176.2(C-4)，157.0(C-7)，155.6(C-5)，149.0(C-4＇)，147.7(C-9)，147.4(C-3＇)，146.9(C-2)，138.3(C-3＇＇)，135.9(C-3)，128.5(C-8)，122.1(C-1＇)，121.8(C-6＇)，119.2(C-2＇＇)，115.7(C-5＇)，111.3(C-2＇)，103.4(C-10)，96.2(C-6)，65.8(C-1＇＇)，60.9(8-OCH3)，55.6(3＇-OCH3)，25.4(C-4＇＇)，18.1(C-5＇＇)。以上数据与文献［5］对照一致，确定该化合物为 3，5，4＇-trihydroxy-8，3＇-dimethoxy-7-(3-methylbut-2-enoxy)flavone。

所有待测样品均配制成浓度为10 mM的DMSO溶液，临用时根据需要稀释。

(三)实验方法。BV-2小胶质细胞用DMEM培养基(加 10%FBS、100 μg·L-1青霉素和 100 μg·L-1链霉素)培养于5%CO2，37℃的培养箱中，传代接种24 h后用于实验。实验时，将LPS(1 mg·L-1)作用于BV-2细胞到指定时间，建立神经炎症模型，使用Gress法［6］测定NO的含量，计算IC50值。

将实验分为对照组、槲皮素阳性组、LPS诱导组、给药组。对照组采用以上DMEM培养液补充体积，其他组用LPS(1 mg·L-1)诱导炎症。阳性组采用槲皮素处理细胞，给药组采用上述化合物协同LPS(1 mg·L-1)处理细胞，以5×104cells·mL-1密度接种于96孔板，每个样品重复测试4次，于37℃、5%CO2条件下培养24小时后，取100μL细胞上清液至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反应10min后测定570nm处的吸收值(OD值)。使用亚硝酸钠标准液绘制标准曲线，根据标准曲线计算细胞培养上清液中NO2-的浓度以及对NO释放的抑制率。

二、实验结果

以槲皮素为阳性对照，按照上述实验方法进行实验，初筛结果如表2。

表2 抗炎活性结果

从上述实验结果，可以得出3个化合物均表现出较好的体外抗炎活性，即对LPS诱导BV-2细胞产生NO的抑制率较高。

三、结语

三叉苦作为岭南地区已经习用的一种地方中药，随着目前很多成方制剂的热销，临床应用越来越广泛。但关于三叉苦的药理作用的现代研究少有报道，对于其发挥临床药效的活性成分尚未阐明。

本文在查阅三叉苦临床应用文献的基础上，对从三叉苦叶中分离得到的三个黄酮类化合物进行体外活性筛选，结果显示三个化合物均有较好的体外抗炎活性，该研究结论与文献记载的按传统中医理论总结的药物功效相一致。本文研究了三叉苦中部分化合物的体外抗炎活性，要充分阐明三叉苦的药效物质，亟待从整体上多种主要成分进行相应的体内外药效学评价。

［1］侯晓丽，孙铭学，高焕焕等.抗炎天然产物活性成分研究进展［J］.药学实践杂志，2015，33(1):20 ～26

［2］江苏新医院.中药大辞典［M］.上海:上海科学技术出版社，1992:68

［3］Zhu S H，Gao Y H，Wei Z X，et al.A new phenylated flavone from Melicope pteleifolia［J］.Chin Herb Med，2011，3(2):81～83

［4］谢郁峰，梁粤，杜清涛等.三桠苦化学成分研究［J］.中药材，2011，34(3):386 ～388

［5］Nasim S，Thomas G H，Peter G W，et al.Two novel prenylated flavones from the aerial parts of Melicope micrococca［J］.Phytochemistry，1999，50:1249 ～1253

［6］Green L C，Wagner D A，Glogowski J，et al.Analysis of nitrate，nitrite，and［15N］nitrate in biological fluids［J］.Analytical Biochemistry，1982，126(1):131 ～138