血管内皮生长因子-C作用下兔舌癌高淋巴结转移动物模型的建立

王 慧，金武龙

血管内皮生长因子-C作用下兔舌癌高淋巴结转移动物模型的建立

王 慧，金武龙

舌癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤，其颈淋巴结转移直接影响患者的生存及治疗。利用血管内皮生长因子-C的生物学作用，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，提高淋巴结转移率，对推动舌癌发病机制和防治措施的研究具有重要意义。作者对血管内皮生长因子-C作用下兔舌癌高淋巴结转移动物模型建立的原理及方法作一综述。

舌癌；淋巴结转移；血管内皮生长因子-C；动物模型

舌癌是最常见的口腔癌，其生物学特征具有生长快、浸润性强、早期可发生淋巴结转移等特点[1-2]。随着诊治技术，尤其是综合序列治疗在临床上的应用，舌癌患者的治愈率和生存率已有明显提高。但局部复发和淋巴结转移仍是舌癌患者主要致死因素，并以区域淋巴结转移为其主要表现形式，也是判断患者愈合的可靠指标。因此，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础。

目前所建立的大动物舌癌模型，均存在淋巴结转移率不稳定、建模周期长、成功率低等缺点。因此，提高舌癌动物模型的淋巴结转移率对舌癌的研究至关重要。

1 舌癌动物模型

人类疾病动物模型是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和材料。使用动物模型是现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。

1.1 舌癌动物模型的种类及优缺点 在舌癌的研究中，以何荣根等[3]首次建立国内第1株人舌癌细胞系Tca8113为开端，舌癌动物模型从化学致癌剂诱发模型、肿瘤移植模型到遗传工程动物模型，经历了一系列不断优化的过程。早期许多学者采用化学制剂诱发舌癌动物模型，常用化学制剂为4-硝基喹啉-1-氧化物，诱发因素、条件可控性强，但动物模型制作周期长，目前广泛应用于舌癌分子学的研究和化学预防药物的研究[4]。移植性肿瘤动物模型包括同种移植和异种移植，人舌癌动物模型属异种移植，将人舌癌组织或细胞系移植到动物体内重新成瘤。该模型不能用于病因学、癌前病变和癌变的研究，但对成瘤、治疗、浸润和转移等研究非常有意义[5]。遗传工程动物模型将目的基因插入到实验动物的基因序列中，最终使外源基因得到表达并可传代。该技术层次达细胞分子水平，由动物整体水平产生效应，因此可以对肿瘤的发病机制、肿瘤细胞与机体之间的免疫学关系、肿瘤的发展演变及凋亡进行更全面的研究[6]；但同时对实验者技术要求高，易发生突变，实验结果可控性较弱。舌癌转基因动物模型选用鼠作为实验动物，产生的原发肿瘤不单一，且不发生转移，这与人舌癌的临床特点有较大区别[7]。因此，在建立舌癌动物模型方法的选择上，对于研究舌癌淋巴结转移发展、转归，选用移植型动物模型较适宜。

1.2 实验动物的选择 舌癌动物模型常用的实验动物有裸鼠、小鼠、大鼠和兔。其中，裸鼠饲养、繁殖条件要求高，实验成本大；小鼠和大鼠虽然繁殖周期短、产仔数多、容易饲养及肿瘤生长迅速，遗传资源极为丰富，但鼠类动物模型在肿瘤感染、免疫与人类有较大差别[8]，且生物存在个体小、淋巴结转移率低的缺点。兔个体相对较大，建模时操作简单、瘤体存活率高、建模周期短，且淋巴管转移方式与舌癌相似，因此与鼠类动物模型相比有很大优势，是现在常用的口腔癌动物研究模型[9]。即通过体内建模后，按照“兔舌癌转移的淋巴结—接种同种异体新西兰白兔皮下扩散—接种到兔舌中1/3黏膜下—淋巴结转移”，多次反复，使兔舌癌的颈部淋巴结转移率达到100%，从而建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。

2 血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也称血管渗透因子。1989年Ferrara等[10]首先从牛垂体滤泡星形细胞体外培养液中分离纯化出血管内皮生长因子，其在人和动物的脑、肾、肝、脾、胰腺和骨骼等组织中均有广泛分布。大量研究资料证实，VEGF的生物学作用可以通过促进肿瘤细胞生长、促进血管生成、促进淋巴管增生、抑制癌细胞的凋亡等直接或间接地促进肿瘤的转移[11]。其中，VEGF-C作为VEGF家族中的一员第1个被发现，是迄今为止发现的唯一具有特异性的淋巴管增生因子[12]，可以诱导肿瘤淋巴管增生，促进肿瘤细胞淋巴结转移。VEGF-C对恶性肿瘤的影响是多方面的，是目前恶性肿瘤研究中非常热门的一个因子。

2.1 VEGF-C与肿瘤淋巴管形成及转移的关系VEGF-C特异性作用于淋巴管内皮，调节并诱导淋巴内皮细胞的增生和转移。研究发现，在人体不同器官的肿瘤组织中均有VEGF-C的表达，且其表达对肿瘤的淋巴结转移有显著的促进作用[13]。Lohela等[14]研究发现，VEGF-C通过激活血管内皮细胞生长因子受体-3来刺激原发肿瘤组织内淋巴血管增生；其血管内皮细胞生长因子受体-2结合使淋巴管的通透性增加，肿瘤细胞更易发生转移，是典型的淋巴管生成因子。田峰等[15]利用免疫组化染色法观察在鼻咽癌组织中VEGF-C、VEGF-D的表达，结果发现VEGF-C、VEGF-D主要表达于鼻咽癌肿瘤细胞的细胞质内，并且证实VEGF-C、VEGF-D的高表达与区域淋巴结转移有密切关系。温玉明等[16]在研究口腔癌VEGF-C及其受体与肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移的关系中发现，有淋巴结转移组比无淋巴结转移组瘤周的血管和淋巴管密度均明显增加，其VEGF-C表达率明显高于非转移组，进一步证明VEGF-C促进了口腔癌周淋巴管和血管的增生。还有学者[17]通过动物模型研究发现，VEGF-C的表达促进肿瘤淋巴管生成。目前，已证实VEGF-C与肿瘤的分化程度、病理分型、侵袭能力、淋巴结转移及预后密切相关[18]。

2.2 VEGF-C在舌癌中的表达 淋巴管增生是恶性肿瘤发生淋巴结转移的一个重要条件。目前大部分研究已经证实，淋巴管生成在发生淋巴结转移的不同舌癌患者中均存在[19]。李慧文和张秀清[20]在研究舌癌组织中发现，VEGF-C在有淋巴结转移组中的表达明显高于无淋巴结转移组，VEGF-C的表达与临床病理间存在联系。证实VEGF-C的表达和肿瘤淋巴结转移有肯定的相关性，VEGF-C诱导的淋巴管增生是肿瘤淋巴结转移的重要环节之一。黄玉娥[21]在舌癌组织与正常舌组织的对比实验中，利用免疫组化染色法检测p53、VEGF的表达，发现在正常的舌组织中p53、VEGF的表达均呈阴性，而在舌癌组织中p53、VEGF的表达高达66%和58%。提示p53、VEGF的表达与舌癌组织病理分级、有无淋巴结转移成正相关(P＜0.05)。因此，p53、VEGF的表达可以作为判定舌癌恶性程度的重要指标。邹浩等[22]研究VEGF-C在舌癌的表达中收集T1、T2期行淋巴结清扫术的舌癌病例74例，进行免疫组化染色后发现，VEGF-C高表达的为39例、低表达的为35例、有颈淋巴结转移的为38例，经统计学分析证实T1、T2期舌癌VEGF-C表达与颈淋巴结转移密切相关，因此可以认为VEGF-C表达对评估早期舌癌颈淋巴结转移有重要意义。同时，实验研究表明，VEGF-C在舌癌的淋巴结转移中起重要作用，VEGF-C的高表达是舌癌颈淋巴结转移的唯一危险因素[23]。另外，郭水根[24]在舌癌组织与正常舌组织的比对实验中，通过免疫组化染色法研究内皮细胞特异性分子(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)、VEGF的表达，结果发现有颈淋巴结转移的舌癌组织中ESM-1和VEGF的表达均明显高于正常舌组织，且晚期舌癌中两者表达也高于早期舌癌，证实ESM-1、VEGF的表达与舌癌的生成、病理分期及淋巴结转移密切相关。

研究结果表明，VEGF-C在舌癌的发生、发展及愈后中起重要作用，利用VEGF-C在舌癌颈部淋巴结转移中起促进作用的优点，提高舌癌动物模型的淋巴结转移率，为建模环节提供良好的理论基础，证实该方法具有可行性。

2.3 VEGF-C基因转染癌细胞的影响 在对VEGFC基因的研究中，潘剑等[25]构建70～419个氨基酸的编码序列，而该序列中缺少信号肽69个氨基酸。Joukov等[26]研究发现VEGF-C变异体，其可模拟并保持VEGF-C多肽活性，无突变。在之后诸多学者的实验研究中，均保留其VEGF-C信号肽部分，完整保留活性，再现人体VEGF-C的生物学作用[27-28]。

单明等[29]在研究VEGF-C基因转染至人乳腺癌MCF-7细胞后，观察VEGF-C表达的变化实验中发现，对照组(未转染MCF-7细胞)细胞全部死亡，而转染组和空载组中细胞存活；且经检测，转染组中VEGF-C表达较空载组显著增强，差异有统计学意义。表明VEGF-C基因顺利导入人乳腺癌MCF-7细胞，为进一步研究建立了平台。陈星等[30]的研究中，将VEGF-C经脂质体成功转染至人宫颈癌HeLa细胞后，重组细胞形态与原始细胞接近，且观察其细胞生长曲线，提示成功转染的细胞比原始细胞生存能力更强。Yonemura等[31]将VEGF-C和VEGF-D的基因转染到胃癌细胞系KKLS得到稳定的转染重组细胞后，将重组细胞系接种到裸鼠胃的浆膜下层及皮下组织，结果在肿瘤组织中有新的淋巴管生成。华成舸等[32]将VEGF-C转染至Tca8113并得到稳定表达，用该重组细胞株建立动物模型，VEGF-C在动物体内也能达到高表达。同时，实验组颈部的高淋巴结转移率具有统计学意义，证实VEGF-C的高表达确实促进了动物移植瘤的淋巴结转移。

近年来，通过VEGF-C基因转染癌细胞得到重组细胞系、建立动物模型的方法，已广泛用于人体各部位肿瘤的基础研究，为实现VEGF-C转染至人舌癌细胞从而建立高淋巴结转移动物模型提供理论与实验基础。

3 基因转染技术

基因转染是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能，核酸包括DNA(质粒和线性双链DNA)、反义寡核苷酸及RNA干扰。基因转染技术已广泛应用于基因组功能(基因表达调控、基因功能、信号转导、药物筛选研究)和基因治疗的研究中。随着基因工程的不断发展，转基因技术已成熟运用于医学的各个领域，目前已广泛用于舌癌的研究中。

建立舌癌动物模型，再现舌癌生物学特点，避免人体试验的风险，对舌癌发生、发展、转归及治疗的研究具有重要意义。利用VEGF-C的生物学特性，通过基因转染技术，培养重组人舌癌细胞系，从而建立具有高淋巴结转移潜能的动物模型，为舌癌的研究搭建一个良好的研究平台。

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Vascular endothelial growth factor-C under high lymph node metastasis of tongue cancer in rabbits animal model

WANG Hui1，JIN Wulong2
(1.Inner Mongolia Medical University，Hohhot Inner Mongolia 010059，China；2.Department of Stomatology，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot Inner Mongolia 010050，China)

Tongue cancer is the highest incidence of malignant tumors of oral cancer，and its high lgmph node has metastasis direct impact on the survival and treatment of patients.The use of the biological role of vascular endothelial growth factor(VEGF-C)by establishing animal models tongue cancer with high potential lymph node metastasis，to increase lymph node metastasis rate.It is important to understand the pathogenesis and control of tongue cancer.Principles and methods on VEGF-C induced rabits tongue cancer in animal models on the mechanism of high lymph node metastasis were reviewed.

Tongue cancer；Lymph node metastasis；Vascular endothelial growth factor (VEGF-C)；Animal model

R739.86－332

A

2095-3097(2015)01-0061-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.01.016

2014-08-14 本文编辑:张在文)

010059内蒙古呼和浩特，内蒙古医科大学(王 慧)；010050内蒙古呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院口腔科(金武龙)