龙血竭总黄酮提取工艺的优化

王少兵, 田 兵，操冰冰，李 竣

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

龙血竭总黄酮提取工艺的优化

王少兵, 田 兵，操冰冰，李 竣

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

为优选龙血竭总黄酮提取工艺，通过单因素考察和正交试验[L9(34)正交表]进行筛选，考察了提取溶剂、提取温度、提取时间和提取次数4种主要因素对提取物中总黄酮含量的影响，确定了龙血竭总黄酮的最佳提取工艺.结果表明：以乙酸乙酯为提取溶剂，10倍溶剂70 ℃下回流提取0.5 h，提取1次，获得提取物中总黄酮质量百分比为54.6.1%，此法可为龙血竭总黄酮的制剂研究奠定基础.

龙血竭；总黄酮；正交试验；提取工艺

龙血竭是百合科剑叶龙血树Dracaenacochinchinensis(Lour.) S. C. Chen的含脂木材经乙醇提取得到的树脂，其基源植物主要分布在越南、老挝和柬埔寨等东南亚国家，在我国主要分布在云南和广西[1].现代药理学研究表明：龙血竭具有活血止血、抗氧化、抗细菌等多种药理活性[2]，所含化学成分主要有黄酮类、萜类、甾体类等[3]，其中以龙血素A、龙血素B为代表的二氢查尔酮类黄酮化合物为其主要活性物质[4].目前关于龙血竭总黄酮的提取工艺和制剂研究报道较少[5,6]，为提高龙血竭产品质量并使之更好地发挥治疗作用，本文采用单因素考察和正交设计试验，探讨了龙血竭中总黄酮成分的提取工艺，为龙血竭总黄酮的制剂研究和产品开发奠定基础.

1 材料和方法

1.1 仪器和材料

紫外可见分光光度计(Lambda 35, 美国Perkin Elmer公司)，电子天平(CP214,上海奥豪斯仪器有限公司)，真空干燥箱(ZKXFB-2, 上海树立仪器仪表有限公司)，龙血竭(西双版纳版纳药业有限公司, 批号120127)，乙醇(国药集团化学试剂有限公司, 批号20150108)，乙酸乙酯(天津博迪化工股份有限公司, 批号20140927)，龙血素B对照品由中南民族大学生物医学工程学院陈素老师提供，纯度98.5%以上.

1.2 分析方法的建立

1.2.1 检测波长的选择

配制龙血素B对照品溶液和样品溶液，于220～400 nm处扫描，紫外吸收图谱见图1.由图1可见，龙血素B的紫外吸收曲线与龙血竭提取物吸收曲线基本一致，且在277 nm处有明显吸收峰，故选择277 nm作为龙血竭总黄酮的检测波长[7].

1.2.2 线性关系的考察

精密称取12.4 mg龙血素B对照品，置于100 mL容量瓶中，加70 %乙醇溶解并定容，分别量取0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mL置于25 mL容量瓶中，加70 %乙醇定容至刻度，于277 nm处测量吸光度，以对照品浓度C(μg·mL-1)为横坐标x，吸光度A为纵坐标y，绘制标准曲线，回归方程为y= 50.3038x- 0.0219，相关系数r= 0.9995，表明龙血素B在1.24 ～12.4 μg·mL-1范围线性良好.

1.2.3 总黄酮的测定

精密称取干燥至恒重的龙血竭提取物50 mg，置于100 mL的容量瓶中，加入70 %乙醇溶解并定溶，量取1 mL溶液置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定溶至刻度，于277 nm处测量吸光度，计算提取物中总黄酮的质量百分比.

2 结果与分析

2.1 单因素考察

2.1.1 提取溶剂的考察

取龙血竭药材10 g，分别加入乙酸乙酯, 90 %乙醇, 80 %乙醇, 70 %乙醇100 mL，70 ℃下回流提取1 h，过滤，减压浓缩，干燥，测定提取物中总黄酮的含量.结果表明：以乙酸乙酯作为提取溶剂优于各浓度乙醇溶液，故选用乙酸乙酯为提取溶剂.

2.1.2 料液比的考察

取龙血竭药材10 g，分别按1∶8, 1∶10, 1∶12, 1∶14和1∶16 (v/w)加入乙酸乙酯，70 ℃回流1 h，过滤，减压浓缩，干燥，测定提取物中总黄酮的含量(结果见图2).图2显示：料液比为1∶10时提取物中总黄酮的含量最高.

2.1.3 提取温度的考察

取龙血竭药材10 g，用10倍量乙酸乙酯回流1 h，提取1次，提取温度分别为60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 90 ℃, 100 ℃，提取后过滤，减压浓缩，干燥，测定提取物中总黄酮的含量(见图3).结果表明：温度为70 ℃时候提取物中总黄酮的含量最高.

2.1.4 提取时间的考察

龙血竭药材10 g，用10倍量的乙酸乙酯70 ℃下提取1次，提取时间分别为0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 h，提取后过滤，减压浓缩，干燥，测定提取物中的总黄酮含量(见图4).结果表明：提取0.5 h总黄酮的含量最大，随着时间的增加提取物中总黄酮的含量略有下降.

2.1.5 提取次数对提取物总黄酮含量的影响

取10 g龙血竭药材，用乙酸乙酯70 ℃回流提取1 h，分别提取1, 2, 3, 4次，过滤，减压浓缩，干燥，测定提取物中的总黄酮含量(见图5).

结果表明：提取1次时总黄酮含量最高，随着提取次数的增加提取物中总黄酮的含量降低.

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，以乙酸乙酯为提取溶剂，考察料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个因素，每个因素3个水平(见表1).

按照因素水平表进行正交试验，正交试验结果如表2和表3.由极差分析可知：影响龙血竭总黄酮提取工艺的因素顺序为B>A>D>C，即料液比>提取温度>提取时间>次数；方差分析中，以影响因素最小的一项作为误差项，所得结果与极差分析结果一致，即影响龙血竭总黄酮提取工艺的因素顺序为B>A>D>C，因素B具有显著性，因素A、C、D无显著性.尽管因素A无显著性差异，但在单因素试验中由A1和A2工艺得到的总黄酮含量分别为49.3%和51.9%，综上考虑选择工艺为A2B2C1D1，即料液比为1∶10，提取温度为70 ℃，提取时间为0.5 h，提取次数为1次.

F0.05(2,2)=19

按照正交试验的优选工艺提取龙血竭总黄酮，重复试验3批，龙血竭提取物中总黄酮平均含量达54.61%(见表4).

3 讨论

目前关于龙血竭总黄酮提取工艺的研究很少.屠鹏飞等[6]采用乙酸乙酯提取和碱溶酸沉的方法提取了龙血竭中总黄酮，利用正交试验考察了乙酸乙酯用量、提取次数、提取时间和NaOH用量.但对于中药的提取纯化工艺，不同工艺过程的影响因素较多，将它们安排在同一个正交试验表内，不能充分考察各影响因素的影响，难以说明工艺的合理性[8]，故不宜将碱溶酸沉的影响因素安排在提取工艺的正交试验表中.

据文献报道，总黄酮含量测定多数以芦丁为对照品，采用Al(NO3)3-NaNO2比色法在510 nm处进行测量[9,10]，但此法用于龙血竭总黄酮的测定存在较大误差[11]，因为龙血竭中黄酮成为主要为二氢查尔酮类，但芦丁结构为黄酮醇类，两者的紫外吸收曲线差异较大，且龙血竭总黄酮在510 nm处吸收强度非常弱.鉴于龙血素B为龙血竭中主要活性成分，中国药典及国家标准[WS3-082(Z-016)-99(Z)]中均规定需以龙血素B为控制指标，故试验中选择以龙血素B为对照品，利用紫外法来测定龙血竭中总黄酮含量.

通过正交试验优选出龙血竭总黄酮提取工艺为：料液比为1︰10，提取温度为70 ℃，提取时间为0.5 h，提取次数为1次. 按照该优选工艺对龙血竭总黄酮进行三次提取，总黄酮平均提取率为70.94%，提取物中总黄酮的质量百分比为54.61%，满足《药品注册管理办法》中中药5类新药关于植物药提取的有效部位含量的要求.与很多其他中药的提取工艺相比，本优选工艺中提取时间偏短、提取次数偏少，主要由于龙血竭本身是龙血树含脂木药材的乙醇提取物，故用乙酸乙酯从龙血竭中提取总黄酮，其提取相对较容易.在龙血竭总黄酮的提取工艺中，提取温度对总黄酮含量具有显著影响，由于黄酮类成分的热稳定性比较差，温度过高容易导致氧化或分解所致[12,13].

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Optimization of the Extraction of Total Flavonoids fromResinaDraconis

Wang Shaobing, Tian Bing, Cao Bingbing, Li Jun

(School of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China )

To optimize the extraction process of total flavonoids fromResinaDraconis, single factor investigation and orthogonal test—a L9(34) orthogonal table were used by considering four major factors: the extraction solvent, extraction temperature, extraction time and extraction cycles. The optimal extraction process was as follow: ethyl acetate as extraction solvent, 10 times ethyl acetate and one extraction for 0.5 h at 70 ℃, with the quality yield of total flavonoids of 54.61%. The study laid the foundation for the pharmaceutical formulation of the total flavonoids fromResinaDraconis.

ResinaDraconis; total flavonoid; orthogonal test; extraction technology

2015-07-24

王少兵(1977-)，男，副教授，博士，研究方向：药物输送系统与药物制剂，E-mail：pharmawang@sina.com

湖北省民族药物现代化工程技术中心开放课题资助项目(2015ZY003)；中央高校自然科学基金资助项目(CZZ15006)

284.2

A

1672-4321(2015)04-0058-04