恐惧记忆的DNA甲基化机制研究进展

李亚红，徐志鹏

(1 中南民族大学 教育学院，武汉 430074；2 广州军区武汉总医院 神经内科， 武汉 430070)

恐惧记忆的DNA甲基化机制研究进展

李亚红1，徐志鹏2

(1 中南民族大学 教育学院，武汉 430074；2 广州军区武汉总医院 神经内科， 武汉 430070)

综述了在恐惧记忆发生过程中DNA甲基化可能的作用机制，指出了中枢神经系统DNA甲基化的改变可以调控基因转录和海马神经发生，甚至通过精子DNA甲基化水平的改变传递给后代，从而参与恐惧记忆的表观遗传修饰.临床研究表明：人类确实存在创伤后应激障碍的代际遗传现象，结合分子生物学的研究成果.探讨了未来有望在创伤后应激障碍等精神疾病诊治上取得的进展.

恐惧记忆；DNA甲基化；海马神经发生

恐惧是机体一种自我保护的防御性情绪过程，在人类的生存及对环境的适应中具有重要的作用.但是，恐惧情绪的过分表达，则可能导致相应的心理障碍，如：创伤后应激障碍(PTSD)、焦虑症、恐惧症等[1].DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，最新研究表明，恐惧记忆可引起脑内DNA甲基化改变，并且遗传给后代[2].恐惧记忆的表观遗传机制是近年来认知神经科学研究的热点问题之一.深入探究恐惧记忆的DNA甲基化机制，能够为病理性恐惧的综合防治提供理论依据.本文从恐惧记忆与DNA甲基化、DNA甲基化参与海马神经发生的调控以及DNA甲基化介导恐惧记忆的遗传等方面展开阐述，并对未来的研究方向进行展望.

1 DNA甲基化

表观遗传修饰是指不改变DNA序列、可遗传地对碱基和组蛋白的化学修饰方式，DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰方式[3].DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(Dnmt)介导将5′-CG-3′(CpG)序列胞嘧啶(C)转化为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，并通过募集和结合甲基化结合蛋白，染色质出现压缩并进一步募集转录抑制因子导致基因表达沉默.DNA甲基化在大多数真核生物中广泛存在，主要参与基因转录调控、基因印记、转座子沉默和X染色体失活等重要的生物学过程[4].

DNA甲基化在哺乳动物基因组内大约占1%，甲基化位点多位于启动子和CpG岛(即CpG高度聚集的结构).当启动子DNA低甲基化时，有利于启动子结合转录因子，促进基因的转录.当启动子DNA高甲基化时，抑制启动子与转录因子的结合，阻遏基因的转录.正常组织中约有70%～90%的CpG位点处于甲基化状态，CpG岛甲基化可直接导致相关基因的沉默.当启动子区有CpG岛基因正常转录时，CpG岛一般不会发生DNA甲基化现象.但在长期不表达基因的启动子区，CpG岛维持较高的DNA甲基化水平[5].在原生殖细胞中，正常表达的启动子区，没有CpG岛基因的转录起始位点附近，其CpG二核苷酸多保持低甲基化水平.在精子细胞、干细胞表达以及组织特异性表达基因多处于较高甲基化水平，在卵子细胞和正常体细胞中基因的甲基化处于较低水平[6].

2 恐惧记忆与DNA甲基化

恐惧记忆是一种常见的海马依赖性情感记忆，恐惧记忆的巩固与增强形成恐惧情绪[7].有研究发现，应激诱发的神经精神类疾病与机体下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的功能异常密切相关[8]，而促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、糖皮质激素(GC)及其受体启动子的甲基化在心理应激反应中发挥着重要作用[9].人类早期创伤记忆可以引起DNA甲基化的变化，并导致相关基因表达发生改变，表明DNA甲基化是对环境应激反应的重要表观遗传调节因子[10].临床研究发现，创伤后应激障碍(PTSD)患者总体DNA甲基化水平增强，其中TPRCLEC9A、APC5、ANXA2和TLR8基因出现明显甲基化现象[11].与正常对照组相比，儿童期曾遭受严重虐待患者海马中有362个启动子出现甲基化变化，其中248个为超甲基化改变，114个为去甲基化改变，而Alsin(ALS2)基因超甲基化并且转录下降与恐惧反应密切相关[12].

脑内DNA甲基化在恐惧记忆的形成、固化和维持过程中均扮演重要的角色.动物研究发现，成年大鼠在经历恐惧刺激后海马区Dnmt基因表达水平出现显著上调，引起记忆抑制基因PP1快速甲基化和转录沉默，同时伴有突触塑形性基因reelin的去甲基化和转录激活，而应用Dnmt抑制剂则可阻断上述变化，并且抑制恐惧记忆的形成与固化[13].在情境恐惧实验中，实验大鼠钙调磷酸酶(CaN)基因至少在刺激后1个月内仍表现出较高的甲基化水平，如果在训练29 d后将Dnmt抑制剂注射到大鼠脑内前扣带回，则可引起CaN表达下降和破坏记忆的保持[14].有研究发现恐惧记忆模型大鼠的DNA甲基化表现出脑区差异性，其背侧海马CA1区脑源性神经生长因子(BDNF)是甲基化明显增强，腹侧海马CA3区甲基化降低，而内侧额叶皮层和基底外侧杏仁核BDNF甲基化无明显改变，表明恐惧刺激可能通过诱导特定脑区DNA甲基化导致海马功能异常[15].进一步研究发现，通过药物手段可抑制DNA甲基化过程，从而能够改变突触可塑性和恐惧记忆[16].小鼠DNA损伤诱导蛋白45β(Gadd45β)基因敲除后，可降低其海马齿状回脑源性神经生长因子 (BDNF) 、成纤维细胞生长因子1(FGF1)启动子甲基化水平，同时小鼠表现出的条件性恐惧记忆明显减低[17].

3 DNA甲基化参与海马神经发生的调控

海马是成年神经发生最活跃、介导恐惧刺激反应最重要的脑区之一，海马神经发生障碍与恐惧记忆形成密切相关[18].DNA甲基化参与调控海马神经发生，并在长期记忆形成过程中发挥关键性作用[13].

3.1 恐惧记忆形成与海马神经发生

海马、杏仁核和内侧前额叶皮层等边缘系统，以及其相关的神经环路是恐惧记忆形成与巩固的神经基础[19].在恐惧记忆形成过程中，大鼠的海马、杏仁核可以观察到长时程增强(LTP)现象，说明恐惧记忆形成与海马、杏仁核的突触可塑性密切相关[20].海马的腹侧区将恐惧刺激信息传导至杏仁体的B神经核，再向杏仁核的中央核进行投射，最后传导至控制恐惧反应表现的相关脑干区域，从而控制机体的恐惧反应[21].

海马神经发生是指海马齿状回形成新生神经元，并且整合到神经环路的生物学过程.海马神经发生主要包括以下4个阶段：神经干细胞和祖细胞的增殖、新神经细胞移行至齿状回颗粒细胞层、神经细胞分化为成熟的神经元、神经元整合到神经环路并发挥生物功能[22].应激刺激可引起海马锥体神经元的树突萎缩，降低海马齿状回前体细胞的增殖，从而损害海马的神经发生[23].相反，在条件性恐惧记忆的消退过程中，海马神经细胞的增殖和存活明显增强[24].临床研究证实，创伤后应激障碍和抑郁症患者的海马体积显著缩小，表明其海马萎缩现象较为明显.以上研究证实，恐惧记忆形成与海马神经发生障碍密切相关.

3.2 DNA甲基化调控海马神经发生

大量研究表明，DNA 甲基化参与海马神经发生的调控过程.DNA损伤诱导蛋白45β(Gadd45β)通过调控DNA的去甲基化水平，明显影响成年神经干细胞增殖和神经元树突发育的生物过程，从而调控环境应激因素引起的成年海马神经发生[25].当改变小鼠脑内DNA甲基化水平时，其海马神经的发生受到明显影响，并且会引起学习记忆功能的改变[26].在对DNA甲基转移酶1(Dnmt1)基因敲除鼠的神经元前体细胞进行培养时，发现其子代细胞死亡较为快速，表明Dnmt1活性降低导致的低甲基化，可使神经干细胞分化功能出现明显障碍，从而干扰新生神经元的存活[27].甲基化CpG结合蛋白2 (MeCP2)基因突变后，可以导致神经发育性疾病Rett综合征，其主要病理改变为大脑皮层广泛的锥体细胞树突数目减少、突触形成不良等[28].

目前研究认为，DNA甲基化在调节神经干细胞的分裂和增殖中发挥重要作用，而DNA甲基化总体水平降低是神经元分化的结果[29].在神经元分化过程中，DNA去甲基化对起主要作用基因的去抑制起关键性的作用，DNA去甲基化可以诱导神经细胞分化为各类功能的神经元[30].

4 DNA甲基化介导恐惧记忆的遗传

恐惧记忆可以通过DNA甲基化方式进行遗传.有研究发现[2]，小鼠在遭受电击等手段后，对苯乙酮可产生条件性恐惧记忆，繁殖的第二代及第三代小鼠均表现出对苯乙酮的恐惧反应，相应嗅球出现结构性改变，并且苯乙酮感受基因Olfr151的CpG岛甲基化水平明显减低，这些现象表明，恐惧记忆可以通过DNA甲基化遗传给子代.同时，将对苯乙酮敏感的雄性小鼠精子进行体外受精，孕育的小鼠仍会表现出对苯乙酮的恐惧反应，其相应精子的苯乙酮感受基因具有较少的甲基化标记，从而导致发育过程中苯乙酮气味的受体基因高表达.进一步实验表明，这一恐惧记忆也可以从亲本向子代进行传递.

人类的创伤恐惧记忆存在代际传递现象.早期应激会导致子代患多种精神疾病易感性升高，从而引起应激反应和某些行为的改变.有研究对689名一战经历者的后代进行跟踪调查，发现约有35%的后代会出现PTSD的临床症状[31].代际传递的症状表现在认知和情感这两个方面，认知层面包括对灾难的预期效应、对灾难重演的恐惧反应、对死亡的侵袭感受和对灾难经验的替代性分享等，在情感方面主要表现为迫害性的梦魇、毁灭性的焦虑、哀悼相关的躁狂心境、面对未解决冲突的愧疚感等.已有研究证实，这种创伤记忆代际传递现象与DNA甲基化密切相关[10, 11].DNA甲基化遗传在一定程度上可以帮助后代避免特定的伤害性刺激，同时也可能明显增加恐惧症或创伤后应激障碍等疾病的发病风险.

5 总结和展望

恐惧记忆受表观遗传调节，而DNA甲基化是其调节的重要方式之一.恐惧记忆可以引起脑内DNA甲基化的改变，其DNA高甲基化水平可以抑制基因转录、降低海马神经发生，并且恐惧记忆能够通过DNA甲基化方式遗传给子代.虽然研究者们从表观遗传学角度对恐惧记忆展开了大量的研究，但至今仍然存在许多未解之谜，今后可在以下两个方面开展研究.

首先，DNA甲基化多态性、差异基因与恐惧记忆的遗传机制.恐惧记忆可通过DNA甲基化遗传，这些差异大多是在全基因组模式上进行的，未来可在DNA甲基化多态性和差异基因方面开展研究，如利用甲基化DNA免疫共沉淀筛选甲基化差异基因，采用亚硫酸盐测序比较CRHR1、GR-1F和BDNF启动子甲基化水平等.同时，通过生物学手段分别干预这些具体的甲基化基因，研究其对恐惧记忆的影响及其作用机制.

其次，不同恐惧消退方式对DNA甲基化的影响机制.恐惧消退主要包括药理学干预和消退训练干预两种方式.药理学干预主要包括作利用γ-氨基丁酸能、谷氨酸能、胆碱能、肾上腺素能、多巴胺能和大麻素能系统的不同种类药物，消退训练包括基于巴甫洛夫条件反射的传统消退训练范式和基于记忆再巩固模型的提取消退训练范式.这些干预方式的效果各异，今后可探讨不同消退方式对子代恐惧记忆易感性的影响及其表观遗传学机制，为人们从基因-环境交互作用层面探讨情感障碍的分子机制提供新的思路，最终为提高并巩固 PTSD 治疗效果提供新的实验依据.

[1] Parsons R G,Ressler K J. Implications of memory modulation for post-traumatic stress and fear disorders [J]. Nature Neuroscience,2013,16(2):146-153.

[2] Dias B G,Ressler K J. Parental olfactory experience influences behavior and neural structure in subsequent generations [J]. Nature Neuroscience,2014,17(1): 89-96.

[3] Ehrlich M,Lacey M. DNA methylation and differentiation: silencing,upregulation and modulation of gene expression [J]. Epigenomics,2013,5(5):553-568.

[4] Keil K P,Vezina C M. DNA methylation as a dynamic regulator of development and disease processes: spotlight on the prostate [J]. Epigenomics,2015,7(3):413-425.

[5] Heller G,Babinsky V N,Ziegler B,et al. Genome-wide CpG island methylation analyses in non-small cell lung cancer patients [J]. Carcinogenesis,2013,34(3): 513-521.

[6] Farthing C R,Gabriella F,Ray Kit N,et al. Global mapping of DNA methylation in mouse promoters reveals epigentic reprogramming of pluripotency gene [J]. PLoS Genetics,2008,4(6): e1000116.

[7] Morgan M,Pfaff D. Effects of estrogen on activity and fear-related behaviors in mice [J]. Hormones and Behavior,2001,40(4):472-482.

[8] Kokras N,Dalla C,Sideris A C,et al. Behavioral sexual dimorphism in models of anxiety and depression due to changes in HPA axis activity [J]. Neuropharmacology,2012,62(1):436-445.

[9] Wan Q,Gao K,Rong H,et al. Histone modifications of the Crhr1 gene in a rat model of depression following chronic stress [J]. Behavioural Brain Research,2014,271: 1-6.

[10] Malan-Müller S S,Hemmings S M J. Understanding posttraumatic stress disorder: insights from the methylome [J]. Genes,Brain and Behavior,2014,13:52-68.

[11] Smith A K,Conneely K N,Kilaru V,et al. Differential immune system DNA methylation and cytokine regulation in post-traumatic stress disorder [J]. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2011,156B,700-708.

[12] Labonte B,Suderman M,Maussion G,et al. Genome-wide epigenetic regulation by early-life trauma [J]. Arch Gen Psychiatry,2012,69,722-731.

[13] Miller C A,Sweatt J D. Covalent modification of DNA regulates memory formation [J]. Neuron,2007,53(6):857-869.

[14] Miller C A,Gavin C F,White J A,et al. Cortical DNA methylation maintains remote memory [J]. Nature Neuroscience,2010,13(6):664-666.

[15] Roth T L,Zoladz P R,Sweatt J D,et al. Epigenetic modification of hippocampal Bdnf DNA in adult rats in an animal model of post-traumatic stress disorder [J]. J Psychiatr Res,2011,45,919-926.

[16] Day J J,Sweatt J D. DNA methylation and memory formation [J]. Nature Neurosci,2010,13,1319-1323.

[17] Leach P T,Poplawski S G,Kenney J W,et al. Gadd45b knockout mice exhibit selective deficits in hippocampus-dependent long-term memory [J]. Learn Mem,2012,19,319-324.

[18] Pan Y W,Storm D R,Xia Z. Role of adult neurogenesis in hippocampus-dependent memory,contextual fear extinction and remote contextual memory: new insights from ERK5 MAP kinase [J]. Neurobiology of Learning and Memory,2013,105:81-92.

[19] Phillips R,LeDoux J. Differential contribution of amyg- dala and hippocampus to cued and contextual fear conditioning [J]. Behavioral Neuroscience,1992,106(2):274.

[20] Yaniv D,Vouimba R,Diamond D M,et al. Simultaneous induction of long-term potentiation in the hippocampus and the amygdala by entorhinal cortex activation: mechanistic and temporal profiles [J]. Neuroscience,2003,120(4):1125-1135.

[21] Segal M,Richter-Levin G,Maggio N. Stress-induced dynamic routing of hippocampal connectivity: A hypothesis [J]. Hippocampus,2010,20(12):1332-1338.

[22] Zhao C,Deng W,Gage F H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis [J]. Cell,2008,132(4):645-660.

[23] Dranovsky A,Hen R. Hippocampal neurogenesis: regulation by stress and antidepressants [J]. Biological Psychiatry,2006,59(12):1136-1143.

[24] Lin C H,Yeh S H,Lu H Y,et al. The similarities and diversities of signal pathways leading to consolidation of conditioning and consolidation of extinction of fear memory [J]. The Journal of Neuroscience,2003,23(23):8310-8317.

[25] Ma D K,Jang M H,Guo J U,et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis [J]. Science,2009,323(5917):1074-1077.

[26] Zhao X,Ueba T,Christie B R,et al. Mice lacking methyl-CpG binding protein 1 have deficits in adult neurogenesis and hippocampal function [J]. Proc Natl Acad Sci,2003,100(11):6777-6782.

[27] Fan G,Beard C,Chen R Z,et al. DNA hypomethylation perturbs the function and survival of CNS neurons in postnatal animals [J]. The Journal of Neuroscience,2001,21(3):788-797.

[28] Feng J,Fan G. The role of DNA methylation in the central nervous system and neuropsychiatric disorders [J]. International Review of Neurobiology,2009,89:67-84.

[29] Costello J F. DNA methylation in brain development and gliomagenesis [J]. Front Bioscience,2003,8: S175-184.

[30] Okuse K,Mizuno N,Matsuoka I,et al. Induction of cholinergic and adrenergic differentiation in N-18 cells by differentiation agents and DNA demethylating agents [J]. Brain Research,1993,626: 225-233.

[31] Karenian H,Livaditis M,Karenian S,et al. Collective trauma transmission and traumatic reactions among descendants of Armenian refugees [J]. Int J Soc Psychiatry. 2011,57(4):327-337.

Progression on DNA Methylation of Fear Memory

Li Yahong1, Xu Zhipeng2

(1 School of Education, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China; 2 Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command, Wuhan 430070, China)

This paper summarized the possible mechanism on the change of DNA methylation in fear memory. The scientists found that DNA methylation in central nervous system regulated the gene transcription and hippocampus neurogenesis. Furthermore, the same changes of DNA methylation in sperms inherited from parents to their offspring, and played an important role in the epigenetic modifications of fear memory. Clinical studies have shown that the symptoms of post‐traumatic stress disorder (PTSD) were transmitted across generations in human. Combining these molecular biology results, the paper discusses the possible methods for the diagnosis and treatment of PTSD in the future.

fear memory; DNA methylation; hippocampus neurogenesis

2013-11-03

李亚红(1979-)，女，副教授，博士研究生，研究方向：应用心理学，E-mail: liyahong003@sohu.com

湖北省自然科学基金资助项目(2014CFB223)

B8409

A

1672-4321(2015)04-0041-04