水稻细胞分裂氧化酶的原核表达

吴云华， 方玉姣

(中南民族大学 生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护和利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

水稻细胞分裂氧化酶的原核表达

吴云华， 方玉姣

(中南民族大学 生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护和利用湖北省重点实验室，武汉 430074)

从水稻日本晴幼叶中提取RNA，以反转产物cDNA为模板PCR扩增得到了细胞分裂素氧化酶基因(CKO)，酶切连接到pET-28a载体上，构建了重组载体pET-28a-CKO，在大肠杆菌BL21中表达了细胞分裂素氧化酶.

细胞分裂素氧化酶；原核表达；载体pET-28a；日本晴

细胞分裂素作为一种植物激素，是目前人们已经知道的5大类植物激素(即生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)之一，它具有腺嘌呤环结构.这类物质的共同特点是在腺嘌呤环的第六位置氨基上有特定的取代物，对细胞的分裂、芽的分化、侧芽的发育、果实的发育等起重要作用.植物中细胞分裂素(CTK)[1]的分解，很大程度上依赖于一种特殊酶的作用实现.这种酶以分子氧为氧化剂，催化CTK的N6上不饱和侧链裂解而使其彻底丧失活性，此反应不可逆，这种酶是细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase，CKO)，它能作用于体内CTK代谢和调节CTK与生长素之间的平衡等.

玉米[2]、拟南芥[3]、石斛兰[4]、大麦[5]、小麦[6]等的细胞分裂素氧化酶基因目前已经被克隆.转基因实验表明：通过改变植物细胞分裂素氧化酶基因的表达可以调控内源激素CTK的含量，进而影响植物的发育.Ashikari M等[7]发现在水稻花序分生组织中的细胞分裂素氧化酶基因OsCKX2的表达受抑制时，会导致细胞分裂素水平增加、发育旺盛、穗粒数明显增多，从而提高水稻产量.但目前关于水稻细胞分裂素氧化酶CKO的原核表达并未见报道，本文利用pET-28a为载体，探索水稻细胞分裂素氧化酶CKO在大肠杆菌BL21中的表达，为细胞分裂素氧化酶CKO生物传感器的制备和应用研究奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

水稻日本晴种子、载体pET-28a、大肠杆菌E.coli.DH5α和E.coli.BL21(DE3) 由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护和利用湖北省重点实验室提供. Trizol Reagent(Ambion)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)，限制性内切酶NdeI、EcoR I、XhoI, T4 DNA连接酶、DNA Maker、蛋白Maker(TaKaRa)，KOD-plus-试剂盒(TOYOBO司)，DNA凝胶回收试剂盒、DNA清洁回收试剂盒(AXYGEN)，卡那霉素(上海生工公司)，二硫苏糖醇(DTT)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG, Alfa Aesar)，苯甲基硫酰氟(PMSF,丁香园)，引物合成和基因测序(擎科生物有限公司)，其他试剂均为国药集团化学和天津市广成化学试剂有限公司等的分析级AR试剂.

PBS缓冲液(pH 7.0, 1 L)：0.27 g KH2PO4，1.42 g Na2HPO4，8 g NaCl，0.2 g KCl，加ddH2O至900 mL混匀，调节pH至7.0，再加ddH2O定容至1L，高压灭菌.Buffer A(1 L)：171.1 g蔗糖，0.186 g EDTA·2Na，12.1 g Tris溶于900 mL ddH2O混匀，用冰乙酸调pH至7.6，再定容至1 L，过滤除菌，存于4℃备用. Buffer B(1 L)：加少量ddH2O溶解1.286 g四水乙酸镁，加入200 mL甘油，13.4 mL 1mol/L KH2PO4, 86.8 mL 1mol/L K2HPO4，加ddH2O至900 mL混匀，调节pH至7.6，再加ddH2O定容至1L，存于4℃备用[8].

精密电子天平(ME204E /02, 上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，PCR仪(PTC-200, 美国Bio-Rad公司)，琼脂糖胶电泳仪(DYY-5, 北京六一仪器厂)，恒温摇床(HQ45Z, 武汉中科仪技术有限公司)，凝胶成像系统(TEL-40Gelvue UV Transilluminator, 英国)，核酸蛋白测定仪(HD-4, 上海泸西分析仪器厂有限公司)，PH计(pHS-3C, 上海仪电科学仪器股份有限公司).

1.2 原核表达载体pET-28a-CKO的构建

用水泡适量日本晴种子，待其发芽后移栽到土中生长，待长出5～6片幼叶后，取日本晴新鲜幼叶，用Trizol法提取叶片的RNA，用反转试剂盒将RNA反转，用水稻Actin引物对cDNA进行检测，以该cDNA为模板，用设计的特异性引物F(5′-ATCCAT ATGGAGGTTGCCATGGTCTGC-3′)和R(5′-CCGCTCGAGGCTATAGCTTGCAAATGCGCC-3′)，设计的酶切位点是XhoI和NdeI，用KOD-plus-试剂盒进行PCR扩增，将扩增所得产物与质粒pET-28a一起先用NdeI在37 ℃酶切过夜，酶切后片段用清洁回收.再分别用XhoI进行37 ℃酶切6 h，酶切的目的片段用清洁回收，质粒pET-28a酶切产物切胶回收后，用T4连接酶将载体和目的片段于16 ℃连接12 h，构建出重组体pET-28a-CKO[9].

将重组体pET-28a-CKO和空载pET-28a分别通过热激转化法转化到相应的感受态细胞E.coli.BL21(DE3)中，其中空载作为对照，分别取200 mL菌液涂布到含抗性的LB平板(含50 μg/mL卡那霉素)上，37 ℃培养箱中过夜培养(12～18 h)，挑取单克隆菌落进行菌落PCR检测，菌落PCR有目的带后对应的单克隆再提取质粒，进行质粒PCR和双酶切鉴定，检测正确的质粒测序.鉴定正确的重组体挑取单克隆于3 mL LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，在摇床中以37℃、180 r/min培养过夜，将培养好的3 mL菌液接种于500 mL TB(含卡那霉素)液体培养基中，培养2～3 h检测其OD值，使其OD600达到约0.6，加入1 mol/L IPTG使其终浓度为1 mmol/L，15℃、180 r/min诱导表达8 h.

1.3 重组蛋白的提取及SDS-PAGE、Western-blot检测分析

于15 ℃8 h，诱导50 mL的菌液，菌液于4℃、5000 g离心15 min，弃上清，收集菌体.冰浴放置30 min后，在4℃、5000 g离心20 min，弃上清，收集菌体，加入Buffer A重悬 (70 mg湿细胞/ mL)，再加入与Buffer A等体积的无菌水，同时加入溶菌酶至其终浓度为0.1 mg/mL，用移液器吹打混匀，冰浴在摇床上轻摇80 r/min 30 min，于4℃、5000 g离心20 min后，弃上清，沉淀中加入Buffer B重悬(0.5 g湿细胞/mL)，并现加DTT至终浓度为0.01 mmol/L，备用的蛋白冻存于-80 ℃.待破碎的，加PMSF至终浓度为1 mmol/L，在冰浴条件下超声破碎，功率为16 W，每次破碎4 s，间歇6 s，一共破碎处理约8 min，使其成为均一的液体.破碎产物于4℃、 14000 r/min离心10 min，吸取出上清备用，沉淀加入PBS缓冲液(pH 7.0)，在冰上放置1 h，对处理好的的上清、混合、沉淀进行SDS-PAGE分析检测和Western-blot分析检测[10].

2 结果与分析

2.1 目的片段CKO的扩增

用Trizol法从日本晴叶片提取RNA，经反转录试剂盒反转出产物cDNA，用水稻actin引物进行检测，检测结果(见图1)正确，可作为扩增模板用于目的片段的扩增.

以检测好的cDNA为模板，用KOD-plus-酶扩增CKO片段，由于第1次扩增的片段很弱，以第1次PCR产物为模板进行第2次PCR条件摸索后，第2次PCR产物的浓度可用于后续的实验(见图2).

2.2 构建原核表达载体pET-28a-CKO

提取载体质粒pET-28a，用EcoR I单酶切检测.用NdeI分别酶切目的片段和载体质粒pET-28a，37℃过夜，回收第一次酶切产物；再用XhoI酶切6h，将第二次酶切的产物回收后，用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物和空载pET-28a分别热激转化大肠杆菌DH5a感受态细胞.对长出的单菌落进行构建载体重组体的检测，结果见如图3.

将构建好的载体经菌落和质粒PCR检测，目的片段大小约为1500 bp，再将重组载体用NdeI和XhoI双酶切检测，结果显示有约5500 bp和1500 bp的条带(见图4)，将鉴定正确的重组载体测序，测序结果100%正确，可用于后续实验.

2.3 CKO蛋白的SDS-PAGE和Western-blot分析

15 ℃下用1 mmol/L IPTG诱导原核表达菌体表达8 h，以空载pET-28a为对照，诱导蛋白通过SDS-PAGE检测，与对照相比，可见蛋白大小在55～70 kDa，进一步进行Western-blot分析检测，分析结果在55～70 kDa处有带His标签的融合蛋白，该蛋白就是目的蛋白CKO，说明CKO重组蛋白成功得到了表达(见图5).

3 结语

本研究利用水稻日本晴为材料，成功构建了pET-28a-CKO重组载体, 采用大肠杆菌菌株BL21(DE3)作为表达菌株，实现了水稻细胞分裂素氧化酶(CKO)的原核表达.表达产物经SDS-PAGE检测和Western-blot分析，目的蛋白获得了成功表达.本研究为后续结合纳米材料放大效应，构建相应的生物传感器和蛋白生理功能研究奠定了基础.

[1] 邓江明,潘瑞炽.细胞分裂素氧化酶[J].植物生理学通讯,1997，33(5):370-375.

[2] Houba-Hérin N, Pethe C, Alayer J, et al. Cytokinin oxidase from Zeamays: purification, cDNA cloning and expression inmoss protoplasts[J].Plant J, 1999, 17(6): 615-626.

[3] Bilyeu K D, Cole J L, Laskey J G, et al. Molecular and biochemical characterization of a cytokinin oxidase from maize[J].Plant Physiol, 2001, 125(1):378-386.

[4] Yang S H, Yu H, Goh C J. Functional characterisation of a cytokinin oxidase geneDSCKX1 inDendrobiumorchid[J].Plant Mol Biol, 2003,51: 237-248.

[5] Petr G, Jitka F, Tomas W, et al. Cytokinin oxidase/dehydrogenase genes in barley and wheat: Cloning and heterologous expression[J]. FEBS J, 2004, 271(20): 3990-4002.

[6] 马 信, 林爱玲, 封德顺，等. 小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达[J]. 生物技术, 2009, 19(1):10-13.

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[8] Li Z, Liu X, Wang C, et al. Expression, purification and direct eletrochemistry of cytochrome P450 6A1 from the house fly, Musca domestica[J]. Protein Expres Purif, 2010,71(1):74-78.

[9] 陈思礼,梅 菊.鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达[J].中南民族大学学报: 自然科学版, 2012, 31(1):16-19.

[10] 吴云华, 邓 欢. 尖镰胞菌细胞色素 P450 55a1 基因超表达载体的构建和水稻日本晴遗传转化[J]. 中南民族大学学报: 自然科学版, 2014, 33(2): 32-35.

Study on the Prokaryotic Expression of Rice Cytokinin Oxidase

Wu Yunhua, Fang Yujiao

(Key Laboratory for Biotechnology of National Commission for Nationalities, College of Life Science, South Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

The total RNA from var nipponbare was extracted and the cytokinin oxidase gene (CKO) was amplified by PCR using the reverse product cDNA as template, thenCKOwas ligated to vector pET-28a after restriction and a recombinant plasmid pET 28a-CKOwas constructed. Finally the rice cytokinin oxidase was expressed inE.coliBL21. The results showed that the recombinant plasmid pET-28a-CKOwas successfully constructed and the prokaryotic expression of rice cytokinin oxidase was achieved.

cytokinin oxidase; prokaryotic expression; pET-28a vector ; var nipponbare

2015-06-26

吴云华(1971-), 女, 教授, 博士, 研究方向: 生化分析与生物传感，E-mail:wuyunhua@mail.scuec.edu.cn

湖北省自然基金资助项目 (2014CFB381)；中央高校自然科学基金资助项目(CZW14008)

Q51

A

1672-4321(2015)04-0037-04