骨髓间充质干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究进展

王苏平，储成艳综述，李 深审校

细胞疗法正处于蓬勃发展的阶段，已经成功治愈一些疾病。然而，对于类似大脑、脊髓这样复杂的器官组织，细胞疗法仍面临巨大的挑战。神经细胞疗法指的是替代丢失或者损伤的神经元及其功能，主要通过移植的细胞定向分化为指定的表型并且整合到组织中或者直接或间接分泌生长因子和神经递质促进神经功能恢复。这种方法仍面临着很多问题包括移植后细胞的存活、细胞命运(比如避免畸胎瘤的形成)、维持指定的细胞分化表型等问题。其中，细胞存活是最具挑战的技术难题之一，例如在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)模型中，只有很小比例的移植细胞(10%～20%)存活时间达到2 w［1］。对于这些问题的解决，寻找可替代的细胞和与组织工程的联合应用显得格外重要。

1 细胞疗法中骨髓间充质干细胞具有突出的优势

有研究曾试图使用胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES)、诱导性多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)、神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)移植来阻止神经元的丢失或者替代它们改善神经功能。但是，这些细胞面临着医学伦理学、细胞来源有限和移植排斥等一系列问题。成体干细胞是成体细胞的一种类型，具有自我复制、多向分化潜能，可以克服免疫排斥和伦理学相关问题及具有从体内分离相对简单和更易整合到脑组织等特点［2］。不仅如此，成体细胞与ES、iPS 相比不易形成肿瘤或者畸胎瘤，成为近期细胞疗法研究的热点细胞。其中，骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，可以横向分化为神经细胞。更加重要的是，它们还可以通过促进神经新生、免疫调节、抑制细胞凋亡等途径来保护和修复神经组织［1，3］。总之，BMSCs 移植到中枢神经系统中是可行的，对人类也是安全的［4～6］。BMSCs 极有可能成为治疗人类中枢神经系统疾病的细胞。

2 BMSCs 用于治疗中枢神经系统疾病的研究进展

2.1 BMSCs 与缺血性脑卒中 在缺血性脑卒中动物模型中，BMSCs 可以提高神经新生、保护神经细胞和减小脑梗死面积等方式改善卒中后运动和认知功能。BMSCs 对神经功能的改善作用很可能是通过直接或间接促进生长因子和其它旁分泌因子的分泌实现，而移植的BMSCs 分化为神经细胞并不是卒中后功能恢复的主要机制，因为在这些研究中移植细胞的存活率很低，分化的细胞数目则更少。最近，McGuckin 等［7］利用哇巴因诱导的大鼠脑缺血模型揭示BMSCs 可以通过降低小胶质细胞和星形胶质细胞活性发挥抗炎作用，同时参与非经典JAK-STAT 信号通路介导的免疫调节作用。研究人员利用大鼠脑梗死模型，比较BMSCs 经颈内静脉输注、颈动脉注射和脑室移植的效应，结果表明经脑室移植途径治疗的大鼠梗死灶面积最小，损伤部位有更多的移植细胞聚集［8］。

BMSCs 治疗缺血性脑卒中的临床试验也在陆续开展。Bang 等［4］给5 例重度缺血性脑卒中的患者静脉输入自体BMSCs，发现接受BMSCs 移植患者的神经功能明显恢复。并在5 y 的随访中，血液、细胞、影像学检查结果均未见明显异常，提示静脉注射BMSCs 是一种简易、安全的疗法。Lee等［5］随机将85 例重度大脑中动脉梗死的患者分成两组，实验组经静脉输注体外扩增的自体BMSCs，在5 y 的研究周期里共有16 例实验组和36 例对照组患者完整地参与了此项研究，结果表明BMSCs 治疗没有任何不良反应，改良Rankin量表评分显示实验组患者功能恢复较对照组更佳，试验还发现移植BMSCs 患者的功能恢复与血清中基质细胞源性细胞因子(Stromal-derived factor 1，SDF1)水平和侧脑室旁区的参与有关。最近，Honmou 等［6］再次为BMSCs 移植的安全性和疗效提供了有力证据，他们将相对大剂量的自体BMSCs 静脉输注到12 例脑卒中患者体内，实验组部分患者在移植后2 w 症状恢复有很大改善。1 y 后对这12 例患者进行影像学和血清学检查，发现患者脑梗死面积减小、没有出现肿瘤和异常细胞生长。

2.2 BMSCs 与脑外伤(Traumatic brain injury，TBI)BMSCs 移植同样被用于TBI 的治疗以达到促进功能恢复的目的，移植的BMSCs 最多只有10%分化为神经元，所以这一机制并不是促进TBI 动物模型功能改善的唯一途径［1］。BMSCs 分泌的生长因子如胰岛素样生长因子-1、血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等促进神经新生、减少神经元的凋亡与丢失和神经组织的重塑可能是引起功能恢复的主要机制［3］。有趣的是，预先低氧刺激的BMSCs 移植后疗效更加显著［9］。最近，对BMSCs 的作用机制又出现一种新的解释，研究发现BMSCs 分泌的基质金属蛋白酶组织抑制因子-3(tissue inhibitors of metalloproteinase-3，TIMP3)可以改善TBI 后血脑屏障的稳定性和通透性［10］。Han 等［11］提出对重度TBI 大鼠的疗效与细胞移植的时间相关，他们分别在TBI后1 d 和7 d 将BMSCs 注射到损伤的胼胝体，结果显示7 d后注射细胞的大鼠功能恢复的更好，而且更加有效地抑制了星形胶质细胞的活性。除了SDF1 可以趋化BMSCs 移向脑组织，Deng 等［12］发现粒细胞集落刺激因子可以调动BMSCs聚集在外w 血中，之后一起向受损的脑组织迁移并分化成神经细胞。尽管这些研究结果都证明BMSCs 可以促进TBI 后功能的恢复，但是受损面积却没有明显变化，组织工程学有可能会解决这一问题。

2.3 BMSCs 与脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)早在2002 年，Hofstetter 等［13］就发现BMSCs 可以促进SCI 后神经功能的恢复，并在受损神经组织中存活，形成与周围正常组织相似的神经纤维。Osaka 等［14］在大鼠SCI 后的不同时间点(6 h 到28 d)给予静脉输注BMSCs 治疗，结果显示治疗越早运动功能恢复的越明显，但仅观察到少数带有神经元和胶质细胞标记物的移植细胞。此外，BMSCs 移植还可以减轻小胶质细胞和星形胶质细胞的反应，增加神经营养因子的产生，保护神经细胞和促进神经轴突、血管的新生［15，16］。有研究采用直接植入损伤部位、脑池注射和静脉输注3 种不同方式探索BMSCs 移植的最佳途径，结果表明在没有植入细胞数目的限制下，脑池注射是最有效且最安全的细胞植入方式［17］。如果将电刺激和BMSCs 联合应用于SCI 治疗会提高移植BMSCs 的存活率、分化和神经纤维的新生，大鼠受损的神经功能恢复效果会更加明显［18］。值得注意的是，与异体移植BMSCs 相比，自体移植对于SCI 的功能恢复更加有效［19］，移植体外已分化成神经样细胞的BMSCs 比移植未分化的BMSCs 疗效好［20］。

Saito 等［21］首先开展BMSCs 治疗SCI 的临床试验，发现经腰椎穿刺鞘内移植BMSCs 治疗的患者没有出现不良反应，移植的细胞可分泌一些营养因子保护神经元和胶质细胞。之后，他们继续使用鞘内注射BMSCs 的方式对5 例因颈髓损伤导致四肢瘫痪的患者进行治疗，患者功能明显恢复，此后随访的1～4 y 中没有出现任何不良反应，再次证明了鞘内移植BMSCs 是安全有效的方式［22］。最近，Karamouzian等［23］采用非随机临床试验方法，利用腰椎穿刺方式将BMSCs 植入11 例胸椎水平SCI 患者的脑脊液中，另外20 例患者接受传统方式治疗，BMSCs 治疗的患者在12～33 m 的随访中没有出现发热、头痛等不良反应，BMSCs 治疗组5 例(45.5%)和对照组3 例(15%)患者功能恢复，提示BMSCs有治疗SCI 的潜能。

2.4 BMSCs 与神经系统退行性疾病

2.4.1 BMSCs 治疗PD 一项有趣的研究报道指出就细胞形态、表型和多向分化而言，正常人和PD 患者分离出的BMSCs 没有明显区别。体外培养的BMSCs 可以分化为多巴胺能神经元，数目最高可达30%，提示这些细胞能够被用于PD 患者持续分泌多巴胺［24］。BMSCs 预先诱导分化成神经元后移植到大鼠多巴胺能传入神经被完全阻滞的纹状体中，与移植单纯的BMSCs 相比，对神经功能的改善更有效。利用微透析技术证明纹状体中部分多巴胺是由移植的BMSCs产生的，有少部分移植细胞拥有神经样形态和神经标记物。实际上，BMSCs 移植引起的神经功能恢复有多种机制能够解释。BMSCs 在动物PD 模型中迁移到损伤部位可能对脑神经起到营养和保护作用，同时也可能促进内源性神经新生。Danielyan 等［25］发现PD 大鼠经鼻内给药后，BMSCs 出现在皮质、嗅球、海马、纹状体等区域，损伤部位的炎症因子水平明显降低，并且完全阻止了6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)导致的多巴胺神经元凋亡。

2.4.2 BMSCs 治疗亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病 纹状体内注射喹啉酸(quinolinic acid，QA)常被用于制作动物亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease，HD)模型。纹状体内直接移植BMSCs 会降低QA 所致的大鼠纹状体萎缩程度，同样，静脉输注BMSCs 能够促进HD 大鼠认知和运动功能的恢复。在大部分实验研究中，只有少数移植细胞具有神经元表型，因此BMSCs 可能主要通过分泌生长因子作为神经营养加强者促进神经细胞存活和其它代偿反应发挥作用［26］。Lin等［27］就发现移植的BMSCs 可通过与宿主组织整合、促进神经细胞的增殖与分化、抗凋亡等方式改善HD 小鼠的运动功能。需要注意的是，自体移植BMSCs 不适用于治疗HD 这类遗传性疾病，因为移植细胞同样带有突变的基因。

BMSCs 可以穿过血脑屏障进入海马，进而改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)大鼠的空间学习和记忆能力。令人惊讶的是，移植细胞在AD 大鼠海马中的存活率大于在正常海马组织［28］。Bae 等［29］证实脑室注射BMSCs 可以急剧降低AD 小鼠脑中淀粉样蛋白(amyloid β，Aβ)的沉积，增强与突触传递相关的关键蛋白(动力蛋白-1)、突触膜蛋白-1 的表达。BMSCs 对Aβ 的这种效应可能与其加速小胶质细胞的激活有关，小胶质细胞可以直接吞噬Aβ［30］。由于AD 脑组织有多个部位损伤，单纯的细胞疗法并不是最理想的治疗手段。因此，即使BMSCs 治疗AD 的研究正在增加，AD 可能不会成为重点研究对象。

3 BMSCs 与组织工程联合应用治疗中枢神经系统疾病

细胞疗法一直受移植后细胞存活率、细胞分化和细胞与宿主的整合等问题的困扰。随着生物医学材料研究的深入，组织工程学很有可能解决这些问题。目前，支架的应用最为广泛，它为移植细胞提供三维的空间支撑，提高细胞存活率，甚至诱导细胞分化。研究已经证实BMSCs 与支架联合应用可以提高对中枢神经疾病的治疗效果。BMSCs 联合胶原支架移植不仅可以促进TBI 后神经功能的恢复还能够加强移植细胞向脑实质迁移，减小受损部位的大小。Jian 等［31］通过比较发现无论是移植细胞的存活率、分化还是神经功能的恢复，BMSCs 联合支架疗法都比单独BMSCs 治疗效果更显著。同样的结论在另一个研究团队中也得到证实［32］。在HPMARGD 凝胶支架联合BMSCs 治疗慢性大鼠SCI 实验中，研究人员发现联合治疗改善了神经功能，阻止受损神经组织的萎缩，并且在凝胶里观察到血管、星形胶质细胞和髓鞘包绕的轴突。Kang 等［33］将单纯BMSCs 移植和与聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)支架联合应用治疗脊髓全横切SCI 进行比较，结果显示只有BMSCs 联合支架组才会有轴突的新生，并且有大量的神经样细胞形成，移植细胞至少可以存活8 w。

4 展 望

BMSCs 对中枢系统疾病的疗效在动物实验中已经得到广泛证实，一些临床试验结果也为其实现临床应用提供了有利的证据。然而，这种治疗方法缺乏长效性，移植细胞的存活率太低，仅仅依靠移植细胞短暂地保护、营养神经无法达到根治疾病的目的。支架能够有效提高移植细胞在体内的存活率，促进细胞分化和其与宿主组织的整合。BMSCs 与组织工程联合应用具有良好的前景，在治疗TBI、SCI 动物实验中已经显现出巨大的优势。近期，有报道指出BMSCs 与富含血小板血浆支架的联合应用在治疗脑出血方面疗效出色［34］。更多支架与BMSCs 联合应用治疗中枢神经疾病的实验研究正在进行。然而，支架与BMSCs 联合应用的研究过程中同样面临挑战，首先是支架的选择，不同的神经组织可能对支架的要求不同。其次，如何将支架和细胞一起运送到受损组织，使治疗过程对宿主的创伤最小。最后，怎样进一步提高支架协同细胞疗法的疗效。

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