抗肿瘤树突状细胞疫苗研究进展

张 米，尹天泉，冯华松

抗肿瘤树突状细胞疫苗研究进展

张 米，尹天泉，冯华松

免疫系统对肿瘤的杀伤作用主要通过细胞毒性T淋巴细胞实现，而树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内唯一能够激活初始细胞毒性T淋巴细胞的专职抗原提呈细胞，在机体抗肿瘤免疫反应中起到重要的桥梁作用。抗肿瘤DCs疫苗旨在通过激活DCs功能进而激活机体的抗肿瘤免疫反应，是近年来肿瘤免疫治疗中的研究热点。作者就抗肿瘤DCs疫苗的研究进展作一综述。

树突状细胞；肿瘤；疫苗；免疫治疗

近年来，肿瘤免疫治疗受到了广泛关注并取得良好进展，抗肿瘤树突状细胞(dendritic cells，DCs)疫苗是其中的研究热点之一[1-3]。作者从DCs的发现与生物学特征、扩增方法以及诱导DCs疫苗成熟的方法、DCs疫苗的负载方法、给药途径、研发存在的问题及应用前景6个方面进行综述。

1 DCs的发现与生物学特征

1973年，Steinman和Cohn[4]在体外培养小鼠脾细胞时发现了一群形态呈树枝状的细胞，因此命名为DCs。此后，Steinman在对其功能的研究中发现DCs是混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)最有力的刺激因素，并推断DCs是激活T、B淋巴细胞活化的“辅助”细胞[5]。这一推断在后来的研究中得到了充分的证实。目前认为，DCs是体内抗原提呈能力最强的专职抗原提呈细胞，也是唯一能够激活初始T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应的细胞[6-7]。DCs无特异性表面标志物，Fms样酪氨酸激酶3受体是其共同表面标志物，小鼠DCs的相对特异性标志物为NLDC145、33D1，人DCs的相对特异性标志物为CD1a、CD11c、CD83和血液树突状细胞抗原2。目前已发现的DCs膜表面分子主要有：①吞噬相关受体包括FcγR、FcεR、Toll样受体(toll-like receptor，TLR)、补体受体、甘露糖受体；②抗原提呈分子包括组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ/Ⅱ类分子、CD1分子；③共刺激分子为CD80、CD86；④黏附分子为CD40、CD54、β1/β2整合素家族等；⑤细胞因子受体为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor，GM-CSFR)、白介素-1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)、IL-10R、IL-4R[8]。

DCs起源于骨髓髓样干细胞和淋巴样干细胞，以未成熟DCs(immature dendritic cells，imDCs)状态广泛分布于除脑组织外的全身各组织器官。imDCs高表达吞噬相关受体，具有强大的抗原摄取能力，摄取抗原后，向淋巴结归巢并逐渐成熟。成熟 DCs (mature dendritic cells，mDCs)丧失抗原摄取能力，高表达MHCⅠ/Ⅱ类分子，以及CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，具有强大的抗原提呈能力，在淋巴结的T细胞区将抗原提呈给T细胞，并分泌细胞因子，激活初始T细胞产生免疫应答。研究表明，imDCs体外激发MLR的能力弱，而mDCs激发MLR的能力强；imDCs诱导免疫耐受，而mDCs激活免疫反应[9-10]。基于imDCs与mDCs在功能上的差异，诱导DCs成熟是DCs疫苗制备中的重要环节[11]。吞噬肿瘤抗原却未能分化成熟的DCs疫苗具有诱发机体免疫耐受，进而促进肿瘤进展的潜在风险。

2 DCs的扩增方法

DCs数量很少，在人的外周血中其数量不足单个核细胞的1%，在小鼠的脾脏中仅占细胞数的0.2%～0.5%。DCs的稳定扩增是DCs疫苗制备的前提条件。因而，很多研究致力于DCs培养方法的探索及不同方法间的比较。目前，已经形成了较为成熟的DCs扩增方法，可供实验和临床应用。

2.1 人DCs的扩增方法 人DCs的扩增多采用外周血来源的单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)[12-14]。PBMCs易于分离，在 GM-CSF和IL-4的作用下，培养5～7 d转化为DCs。每10 mL血可培养出(0.5～2)×106个DCs，其中95%～99%细胞呈CD1a+CD14-CD83lo/-表现。当培养时间超过8 d时，DCs会自发成熟，伴随CD83上调。目前，人DCs的培养技术已比较成熟，其数量和质量均可满足临床应用。

2.2 小鼠DCs的扩增方法 自1992年Inaba等[15]报道大量扩增DCs的方法以来，DCs的培养方法已历经多次改良。由于用小鼠PBMCs培养DCs所获得的细胞数量较少(约1×105个/只)，小鼠DCs的体外扩增多采用骨髓来源的前体细胞，在GM-CSF和IL-4的作用下转化为DCs，但各实验室所采取的浓度及培养时间有所差异[15-18]。一般采用8～12周龄的小鼠，可培养出足够数量的DCs(约5×106个/只)。此外，还有学者尝试应用Fms样酪氨酸激酶3配体在体内扩增DCs，实验证明该方法可有效扩增DCs数目至20倍左右[19]。但DCs的体内扩增可控性较差，目前技术手段仍欠成熟，实验中多数采用体外扩增培养的方法。

3 DCs疫苗的负载方法

DCs是免疫系统对抗肿瘤的始动环节，因而许多学者试图通过激活DCs对肿瘤抗原的吞噬、提呈功能来激发机体的抗肿瘤免疫反应。而如何使DCs吞噬目的抗原，即负载DCs，是制备DCs疫苗的首要步骤。目前，已研发出多种DCs疫苗负载方法，不同方法负载的DCs疫苗所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，并有各自的优缺点。

3.1 肿瘤抗原肽负载的DCs疫苗 肿瘤抗原肽冲击负载的DCs疫苗有较大的选择性，不易产生自身免疫反应。但大多数MHC限制性肿瘤抗原肽的半衰期仅2～10 h；若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原多肽的DCs。有研究发现，卵清蛋白可作为辅助蛋白用于肿瘤抗原肽负载DCs疫苗的制备，其治疗效果明显优于对照组[20]。

3.2 全细胞抗原负载的DCs疫苗 全细胞抗原负载DCs是目前广泛采用的方法，用反复冻融、超声破碎、放射线照射等方法获得肿瘤细胞裂解物，直接负载DCs。它包括了所有已知、未知的肿瘤相关抗原(tumor associated antigens，TAAs)和肿瘤特异性抗原(tumor specific antigens，TSAs)，不需要鉴定分离肿瘤TAAs或TSAs，制备方法简便。已有实验证实，冻融的肿瘤细胞可在体外致敏DCs[21-22]。还有学者尝试氩氦冷冻消融术后瘤体内注射DCs，从而在体内负载DCs疫苗，实验表明该方法可降低肿瘤的复发率、延长生存时间[18，23]。目前，已报道的用于DCs疫苗研究的肿瘤模型多样，包括Lewis肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌，均获得了良好的治疗效果[24-29]。说明DCs疫苗应用范围较广，无明显的肿瘤组织类型特异性。

3.3 基因修饰的DCs疫苗 肿瘤抗原基因转染的DCs疫苗可使DCs持续以合适的方式将肿瘤抗原的表位与MHC结合，表达于DCs的表面，从而更有效地激活T细胞产生抗肿瘤免疫应答反应[30]。但目前仅有少数几种肿瘤如黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌鉴定了能被T细胞表位识别的肿瘤抗原决定簇，多数肿瘤缺乏明确的TSAs、TAAs。因此，用已知少数的几种特异抗原转染DCs治疗肿瘤，其应用范围较小；当肿瘤细胞发生突变而丧失其特异抗原时，这种单一肿瘤抗原负载的免疫细胞将无法有效识别，而且可能产生与宿主细胞基因组整合的危险。用利于向辅助性T细胞1方向极化的细胞因子基因转染DCs细胞，可有效地激活 CTL反应。已有研究表明，将IL-7、IL-12、IL-18、肿瘤坏死因子-α细胞因子基因转染DCs可提高激活抗肿瘤特异性T细胞的能力[31-32]。

3.4 肿瘤细胞与DCs融合 与肿瘤细胞融合后的DCs可表达全部TAAs和TSAs，有关实验表明细胞融合疫苗可有效刺激CD4+T、CD8+T细胞及自然杀伤细胞的抗肿瘤免疫反应，对原发瘤及转移瘤均可产生有效的抑制作用[33-34]。

3.5 热休克蛋白负载的DCs疫苗 从肿瘤组织中纯化的热休克蛋白结合了多种肿瘤细胞特有的抗原肽，可通过DCs表面的受体直接使伴侣分子抗原肽经MHCⅠ类分子提呈，激发机体产生抗肿瘤特异的多个和多种CTL克隆(αβCTL和γδCTL)，杀伤肿瘤细胞，但其提取、纯化过程复杂，限制了它们的临床应用[35-36]。

4 诱导DCs疫苗成熟的方法

DCs的成熟是DCs疫苗制备中的关键环节。表达于DCs表面的TLR，主要识别脂多糖等病原体保守结构。TLR结合配体后，通过髓样化因子88、核因子-κB多条信号途径，启动细胞活化进程，上调主要MHC、CD80、CD86等共刺激分子表达，分泌肿瘤坏死因子、IL-6迅速激活天然免疫系统。TLR的主要配体包括G-菌的脂多糖、类脂A、革兰阳性菌的肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、疏密螺旋体的脂蛋白、酵母多糖和细菌DNA、非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸，是促进DCs成熟的高效刺激物。研究中应用较多的免疫佐剂为卡介苗细胞壁骨骼、脂多糖和非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸，实验表明这些免疫佐剂可有效刺激DCs疫苗的成熟，增强疫苗的抗肿瘤作用[37-38]。此外，还有学者尝试用γ-干扰素诱导出半成熟状态的DCs，这样DCs既保留了吞噬抗原的能力，也可在吞噬抗原后分化成熟[39]。成熟的DCs高表达MHCⅠ/Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40及黏附分子。目前，疫苗制备中多采用流式细胞术检测CD80、CD86的表达来鉴别DCs的成熟度。

5 DCs疫苗的给药途径

DCs疫苗的给药途径主要包括静脉注射、皮下注射、皮内注射、瘤体内注射方法。其中，皮下注射治疗组治疗效果优于静脉注射组，肝、脾的破坏是导致静脉注射治疗效果欠佳的主要原因；而归巢率较低是制约皮下和皮内注射组治疗效果重要因素；瘤体内注射法难度相对较大，具体操作方法、作用机制还有待更加深入地研究[40]。

6 DCs疫苗存在的问题

理想的抗肿瘤DCs疫苗制备方法应具备：①能够扩增数量足够并具有良好活性的DCs；②在摄取抗原前应维持DCs的未成熟状态；③在吞噬抗原后应确保DCs分化成熟；④回输体内的DCs能够顺利归巢，激活初始CTL反应，诱导抗肿瘤特异性免疫反应；⑤具有较长效的抗肿瘤作用；⑥避免诱导自身免疫反应。目前，DCs疫苗的研发依然存在一些问题：DCs的扩增在数量上基本能够满足实验及临床需要，但不同方法扩增的DCs在疫苗制备中是否存在差异，还需进一步比较；由于imDC与mDC在功能上存在很大差异，为充分发挥其抗原摄取与提呈的双重功能，刺激DCs成熟的合适时机尚需进一步探讨；DCs在体内的归巢率低，是制约DCs疫苗治疗效果重要因素，如何提高DCs疫苗的归巢率，是DCs疫苗研发过程中必须攻克的一大难题。

7 DCs疫苗的应用前景

目前，DCs疫苗的抗肿瘤作用已在多种肿瘤动物模型上得以证实。研究表明，DCs疫苗可诱导辅助性T细胞1型免疫反应，有效刺激肿瘤特异性CD8+T细胞增殖，可使肿瘤体积缩小或消失，降低肿瘤复发率，延长动物生存时间[41]。临床试验证实，DCs疫苗具有良好的相容性，是安全、可行的治疗方法[42]。这些结果彰显了其良好的临床应用前景。虽然目前抗肿瘤DCs疫苗尚未取得令人满意的临床治疗效果，但其研发为肿瘤的治疗带来了新的方法，为肿瘤患者带来了新的希望。未来研究中，对上述DCs疫苗存在问题的解决，必将为其广泛的临床应用打下坚实的基础，推动肿瘤治疗的发展。

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Advance in anti-tumor dendritic cell vaccines

ZHANG Mi1，YIN Tianquan2，FENG Huasong3
(1.Medical School of Chinese PLA，Beijing 100853，China；2.Department of Emergency，Beijing Chaoyang Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100020，China；3.Department of Respiratory Medicine，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Cytotoxic T lymphocytes(CTL)are the main effector cells in the anti-tumor immune response.Dendritic cells(DCs)，which are considered to be the most potent antigen presenting cells(APC)in the body，are the only cells that can activate cytotoxic T lymphocytes and thus play an important role in the anti-tumor immunity.Research in DCs-based vaccines has evoked great interest and made much progress in recent years.Advance in anti-tumor DCs vaccines is to be reviewed here.

Dendritic cells(DCs)；Tumor；Vaccines；Immunotherapy

R730.51

A

2095-3097(2015)06-0365-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.06.013

2015-06-14 本文编辑：张在文)

100853北京，解放军医学院(张 米)；100020北京，首都医科大学附属北京朝阳医院急诊科(尹天泉)；100048北京，海军总医院呼吸内科(冯华松)

冯华松，E-mail：fenghs99＠163.com