川芎嗪对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响及机制

张男，赵茗，孙亚澎

（河北医科大学第三医院脊柱外科，石家庄050051）

川芎嗪对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响及机制

张男，赵茗，孙亚澎

（河北医科大学第三医院脊柱外科，石家庄050051）

目的 探讨川芎嗪对大鼠脊髓损伤（SCI）后运动功能恢复的影响及可能的机制。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只，随机分为川芎嗪治疗组（TMP组）、单纯脊髓损伤组（SCI组）和假手术组（Sham组），每组20只。Sham组只暴露脊髓，不打击。SCI组和TMP组采用Allen法损伤大鼠T9脊髓节段，复制SCI动物模型。造模成功后30 min，TMP组腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，每日1次，共7次；SCI组和Sham组腹腔注射等体积的生理盐水。于术后1、3、7、14 d随机抽取各组动物5只，进行后肢功能Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分、脊髓组织HE染色、脊髓组织中白细胞介素（IL）17和磷酸化的信号转导与转录激活因子3（pSTAT3）表达水平的检测。结果与Sham组相比，SCI组术后各时间点BBB评分均显著降低，形态学出现典型的SCI改变，脊髓组织中IL-17和pSTAT3表达水平显著升高（P＜0.05）。与SCI组相比，TMP组术后3、7、14 d BBB评分均显著升高，SCI改变减轻，脊髓组织中IL-17和pSTAT3表达水平显著降低（P＜0.05）。结论川芎嗪可通过抑制STAT3活性降低IL-17水平，促进SCI大鼠运动功能的恢复。

脊髓损伤；川芎嗪；大鼠；运动功能；白细胞介素17；磷酸化的信号转导与转录激活因子3

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，导致损伤部位以下运动和感觉功能障碍［1］。SCI严重的病理后果和高昂的治疗费用给患者带来极大的痛苦，同时也成为巨大的社会医疗负担。但是目前尚无治愈SCI的医疗措施，因此SCI的修复和康复治疗研究具有重要的临床意义。SCI的病理生理学过程包括初始的原发性损伤以及由此引发的继发性损伤。原发性SCI是脊髓组织遭受外力损伤后瞬间引起的组织损坏，是不可逆性损伤。损伤后在原发性损伤的基础上因多种因素参与而引发的脊髓组织进行性、自毁性级联放大的破坏过程称为继发性SCI，其损害程度远远超过了原发性SCI［2］。因此，研究继发性SCI的发生机制，在预防和逆转继发性SCI以及最大程度地保留残存的脊髓功能及促进损伤脊髓结构和功能重建具有重要意义。白细胞介素（interleukin，IL）17是最近新发现的具有强致炎性作用的细胞因子，主要来源于CD4+T细胞亚群中的T辅助细胞17（T helper 17，Th17）细胞。而信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的异常激活能够调控Th17细胞的分化，促进IL-17的分泌［3］。近来研究发现，STAT3及其调节的IL-17表达参与继发性SCI的发生和发展［4，5］。

川芎嗪具有离子通道阻断、抗炎、抗氧化、抗凋亡等广泛的生理药理学作用［6，7］。多项研究证实川芎嗪可促进SCI后运动功能恢复［8～10］，但确切的机制还不清楚。川芎嗪能否通过抑制STAT3活性减少IL-17的表达、促进SCI后运动功能恢复未见报道。本研究通过测定TMP处理的SCI大鼠模型脊髓中炎性因子IL-17、pSTAT3表达水平，观察脊髓组织形态学变化及评价后肢运动功能的方法，研究川芎嗪对SCI后大鼠运动功能恢复的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄不限，体质量（250±20）g，购自河北医科大学实验动物部。将60只大鼠随机分为川芎嗪治疗组（TMP组）、单纯脊髓损伤组（SCI组）和假手术组（Sham组），每组20只。

1.2 主要试剂和仪器

IL-17兔单克隆抗体和pSTAT3兔单克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。全自动酶标仪和电泳仪购自美国Bio-Rad公司；Dounce匀浆器购自美国Wheaten公司；-80℃超低温冰箱购自美国Thermo公司；高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。

1.3 模型制备

戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定于手术台上，初步定位T9棘突位置。背部正中剃毛，暴露皮肤，常规消毒铺无菌洞巾后，切开大鼠的皮肤，刀柄分离棘突两侧肌肉，暴露棘突及椎弓板，咬骨钳咬除棘突及椎板，暴露脊髓，保证硬脊膜完整。参照Allen′s方法制作简易打击模型：由不锈钢材料制成，击打棍直径4.0 mm，打击头呈凸形，质量20 g，击打棍套管内直径4.1 mm，打击高度为2.5 cm，以出现脊髓充血、双下肢痉挛抖动、尾巴痉挛性摆动视为造模成功。打击完毕，逐层缝合肌肉和皮肤。并立即腹腔注射0.9%氯化钠注射液9 mL/kg以补液。待动物清醒后放回饲养笼中单笼饲养。术后3 d内，每天腹腔注射8×104U青霉素钠以防感染。术后大鼠可自由饮水、进食，饲养环境中须保持适宜的温度和湿度，定时清洁笼具，并保持大鼠身体干燥，每天挤压膀胱排尿3次，至大鼠恢复自主排尿。

1.4 治疗方法

TMP组：造模成功后30 min腹腔注射川芎嗪200 mg/kg，此后每天按相同剂量注射1次，共7次。SCI组和Sham组：造模成功后腹腔注射等体积生理盐水。

1.5 评定方法

术后1、3、7、14 d分别从各组随机抽取5只大鼠进行评分和相关测定。

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分：评分标准：第1步（0～7分）评判动物后肢各关节活动；第2步（8～13分）评判动物后肢的步态和协调功能；第3步（14～21分）评估动物运动时爪子的精细运动；3项满分21分。采用双盲法，每次评分由经培训后的两人分别独立完成，左右两侧分别评分后取平均值作为最后评分。

1.5.2 HE染色：每个时间点每只大鼠随机选取2张切片进行HE染色，损伤严重段脊髓取视野，光镜下观察脊髓组织形态学变化。

1.5.3 Western blot：收集脊髓组织并提取蛋白，上样蛋白30 μg，电泳（10%SDS-PAGE凝胶），转印（80 V，120 min），5%正常小牛血清封闭，抗pSTAT3（1∶10 000，美国Abcam公司）、抗IL-17（1∶1 000，美国Abcam公司）和抗β-actin（1∶1 000，美国Abcam公司），4℃孵育过夜，分别与各自对应的二抗（北京中杉）室温孵育2 h，加ECL显色剂（北京中杉）1 min，X线胶片曝光成像。结果经自动电泳凝胶成像分析仪（Chemi Image 5500，美国Alpha Innotech）采集，进行灰度值分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

Sham组术后如正常大鼠，SCI组及TMP组大鼠的术后情况基本一致，打击后大鼠均表现为身体痉挛性颤动，尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩样扑动。麻醉苏醒后大鼠双下肢呈弛缓性瘫痪，可出现尿潴留或尿失禁。术后3 d大鼠开始少量活动，进食少，尿潴留较严重，部分动物伴有血尿及腹部胀气症状。此后饮食及活动逐渐增加。大鼠伤口未见感染，身体未出现压疮；经人工按摩膀胱5～7 d后，所有大鼠基本能够恢复自主排尿。

2.2 运动功能的判定结果

采用BBB评分方法对大鼠SCI后1、3、7及14 d的后肢运动功能进行评估，见图1。Sham组大鼠术后功能完全恢复；SCI组和TMP组后肢的运动功能均有所改善，TMP组改善更显著，术后3、7、14 d SCI组和TMP组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 脊髓组织形态学观察结果

如图2所示，Sham组神经细胞及神经胶质细胞形态规则，白质致密，胞膜、核膜清晰，胞核大而圆，位于细胞中央，核染色质少，呈淡蓝色，核中央有一清楚核仁，胞质呈淡红色。SCI组出现典型的损伤改变，表现为炎性细胞增多，神经元水肿、变形，空泡形成。TMP组SCI明显减轻。

2.4 脊髓组织中IL-17和pSTAT3表达水平的变化

如图3所示，Sham组IL-17和pSTAT3表达各时间点基本无变化。SCI组损伤后1、3、7及14 d IL-17和pSTAT3表达均出现不同程度升高，与Sham组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。TMP组术后3、7、14 d IL-17和pSTAT3表达均明显低于SCI组（P＜0.05）。

3 讨论

川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，属酰胺类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪，有抗肿瘤血管生成、抑制血管内皮细胞的增殖、抗血小板聚集和抗炎等作用，目前已广泛应用于临床。近来研究证实川芎嗪可改善SCI后的神经功能的恢复［8～10］。本研究发现川芎嗪可显著提高SCI大鼠BBB评分，改善SCI后的病理改变，这与以往的报道一致［8～10］。

损伤后局部免疫炎性反应是继发性SCI主要机制［11］。SCI后缺血坏死的神经元、胶质细胞及内皮细胞均可产生大量炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α、IL-1β、IL-18、IL-10等［12］。它们可刺激其他细胞因子和炎性介质的产生，影响神经胶质细胞的基因表达。这些细胞因子可作为内皮细胞活化的信号分子，从而刺激细胞黏附分子的分泌及白细胞与内皮细胞之间的黏附，这样将会诱导白细胞向损伤区的浸润，进一步加重SCI。

IL-17是最近新发现的具有强效致炎作用的细胞因子，主要来源于CD4+T细胞亚群中的Th17细胞，与多种感染性疾病、自身免疫性疾病及炎性反应的发生发展过程有着密切的联系，近几年来成为各个领域的研究热点。大量研究证明，IL-17的主要生物学效应是促进炎性反应，还可以同肿瘤坏死因子α等协同作用，加大、加强其致炎效应［13］，同时发现IL-17还参与中性粒细胞、树突状细胞的增殖、成熟以及趋化过程［14］。STAT3是一种重要的核转录因子，pSTAT3进入核后发挥重要功能，调节大量的基因表达。近年来研究报道，在Th17细胞分化过程中，IL-6、IL-21、IL-23及转化生长因子β等多种细胞因子共同作用下，STAT3转化为pSTAT3并形成二聚体进入细胞核，与IL-17启动子直接结合并且调节其转录，进一步促进Th17细胞的分化［15］。本研究发现，SCI组损伤后1、3、7及14 d IL-17表达水平均出现不同程度升高，TMP处理后IL-17表达水平明显降低。这提示SCI后IL-17大量产生，激活全身炎性反应。川芎嗪可抑制IL-17产生，从而减轻SCI后的炎性反应。进一步检测pSTAT3发现，SCI组损伤后1、3、7及14 d pSTAT3水平均出现不同程度升高，TMP处理后pSTAT3水平明显降低。提示川芎嗪可能通过抑制STAT3磷酸化抑制IL-17产生，从而减轻SCI后的炎性反应，发挥促进SCI恢复作用。

本研究结果证明，川芎嗪对SCI后动物运动功能恢复的促进作用与其抑制STAT3磷酸化及IL-17表达作用有关，这为川芎嗪在SCI治疗的临床应用提供了一定的理论基础，但其促进脊髓功能恢复的具体机制还有待于进一步研究。

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（编辑 陈 姜）

Effect and Mechanism of Tetramethylpyrazine on Motor Function after Spinal Cord Injury in Rats

ZHANG Nan，ZHAO Ming，SUN Ya-peng
（Department of Spine Surgery，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveTo observe the effect and mechanism of tetramethylpyrazine（TMP）on motor function after spinal cord injury（SCI）in rats.MethodsTotally 60 healthy adult Sprague-Dawley rats were divided randomly into TMP group，Sham group and SCI group with 20 rats in each group.The Sham group was only exposed spinal cord without imposing any harm.SCI group and TMP group were treated with Allen′s mode at the level of the 9th thoracic vertebra to imitate spinal cord injured animal models.30 min after SCI model was made，TMP group was given 200 mg/kg TMP daily for 7 times by intraperitoneal injection，while SCI group and Sham group were given an equal volume of normal saline daily.On the 1st，3rd，7th and 14th days after SCI，5 rats were selected randomly from each group.The motor function was assessed by Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）scale.The pathological changes of spinal cord tissue were determined by HE staining.The interleukin 17（IL-17）and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3（pSTAT3）expression were determined by Western blot.ResultsCompared to Sham group，the BBB scores in SCI group were significantly increased，HE staining presented typical pathological changes of spinal cord injury in SCI group，meanwhile the expression of IL-17 and pSTAT3 in the spinal cord tissue in SCI group were all significantly increased（P＜0.05）.Compared to SCI group，BBB scores in TMP group were significantly increased on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the pathological changes of spinal cord injury in TMP group was alleviated on the 3rd，7th and 14th days after SCI，the expression of IL-17 and pSTAT3 in TMP group were reduced on the 3rd，7th and 14th days（P＜0.05）.ConclusionTMP may reduce the expression of IL-17 by inhibiting the activity of STAT3 and promote the recovery of the motor function in rats after SCI.

spinal cord injury；tetramethylpyrazine；rats；motor function；interleukin 17；phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3

R651.2

A

0258-4646（2015）01-0060-04

张男（1983-），男，主治医师，博士. E-mail：William.nan@163.com

2014-10-12

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