慢性脑缺血大鼠模型中海马神经元凋亡与缺血时间的相关性

杨振军，史昌乾，薛景凤

（1.承德医学院解剖教研室，河北承德067000；2.武警辽宁总队大连医院院长办公室，辽宁大连116013）

慢性脑缺血大鼠模型中海马神经元凋亡与缺血时间的相关性

杨振军1，史昌乾2，薛景凤1

（1.承德医学院解剖教研室，河北承德067000；2.武警辽宁总队大连医院院长办公室，辽宁大连116013）

目的 探讨慢性脑缺血加速大鼠海马神经元凋亡的作用，初步阐明其机制。方法健康成年雄性SD大鼠90只，随机分为假手术组（n=30）和实验组（n=60），分别于术后第7、14和21天处死取材，每个时间点随机选取假手术组大鼠10只、实验组大鼠20只。实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉的方法，建立慢性脑缺血模型；假手术组颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，不做结扎。硫堇染色观察大鼠海马神经元的形态变化；SP免疫组织化学法观察海马神经元Bax和Bcl-2蛋白表达的动态变化；单宁酸-氯化铁媒染法观察大鼠海马微血管构筑的动态变化。采用MiVnt图像分析系统对大鼠海马神经元Bax和Bcl-2蛋白表达、海马微血管密度（MVD）、微血管面积（MVA）进行定量分析。结果实验组大鼠海马神经元Bcl-2蛋白的表达率与假手术组相比明显降低（P＜0.05）；且随缺血时间的延长，Bcl-2蛋白的表达率逐渐下调，21 d实验组明显低于与7 d实验组（P＜0.05）。实验组大鼠海马神经元Bax蛋白的表达率与假手术组相比明显升高（P＜0.05）；且随缺血时间的延长，Bax蛋白的表达率逐渐上调，21 d实验组明显高于7 d和14 d实验组（P＜0.05）。实验组各时间点大鼠海马的MVA和MVD均较假手术组明显下降（P＜0.05）；随着造模时间的延长，MVA和MVD逐渐下降，14 d和21 d实验组的MVA和MVD明显低于7 d实验组（均P＜0.05），且21 d实验组的MVD明显低于14 d实验组（P＜0.05）。结论慢性脑缺血可致海马MVA、MVD及Bcl-2蛋白的表达进行性下降，Bax蛋白的表达进行性增高，进而导致学习和记忆功能障碍逐渐加重，这可能是血管性痴呆的原因之一。

慢性脑缺血；海马；Bcl-2；Bax；微血管构筑

血管性痴呆在痴呆的发病中居第二位，随着人口老龄化及饮食结构的改变，血管性痴呆的发病呈增长趋势［1］。慢性脑缺血是导致血管性痴呆的主要原因，血管性痴呆发病早期以认知功能损害为主要表现，最终可导致持久或进行性的认知与神经系统功能障碍［2］。海马与学习记忆密切相关，是大脑近期记忆环路的主要结构［3］。有研究表明：慢性脑缺血可以导致大鼠海马神经元功能障碍［4，5］，但关于慢性脑缺血模型建立后，海马微血管构筑及Bcl-2、Bax蛋白表达率的动态变化报道较少。本研究采用单宁酸-氯化铁媒染法观察慢性脑缺血大鼠模型建立21 d内海马微血管构筑及其动态变化，Bcl-2、Bax蛋白表达率的动态变化，为探讨慢性脑缺血导致记忆障碍的机制及寻找干预慢性脑缺血引起脑损伤的方法，提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠90只，体质量250～300 g（购于河北医科大学实验动物中心，合格证号：11400700005419，清洁级大鼠，常规饲养）。大鼠随机分为假手术组（n=30）和实验组（n=60）。实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉的方法，建立慢性脑缺血模型［6，7］，假手术组切开颈部皮肤，分离双侧颈总动脉，不做结扎。

1.2 取材及观察

1.2.1 单宁酸-氯化铁染色：分别于术后第7、14和21天处死取材，每个时间点随机选取假手术组大鼠5只、实验组大鼠10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打开胸腔暴露心脏，经左心室至升主动脉插管，200 mL温生理盐水（37℃）快速冲洗血管后，用0.1 mol/L磷酸缓冲液、4%多聚甲醛和10%单宁酸的混合媒染固定液250 mL灌流固定，4 h后断头取脑［8］。小心剥除颅骨和周围软组织后，取出脑组织，截取视交叉平面至大脑横裂的一段脑组织。Leica振荡切片机连续冠状切片，片厚50 μm，自海马水平部出现开始，每隔2片取1片，放入2%氯化铁溶液中显色，蒸馏水漂洗，裱于涂有APES的载玻片上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，Olympus光学显微镜下观察并摄片。

1.2.2 硫堇染色：常规硫堇染色，Olympus光学显微镜下观察（10×10）并摄片。

1.2.3 免疫组织化学染色：分别于术后第7、14和21天处死取材，每个时间点随机各取假手术组大鼠5只、实验组大鼠10只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌流固定，4 h后取脑，截取视交叉平面至大脑横裂的一段脑组织，4%多聚甲醛后固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚6 μm。自海马水平部出现开始，每隔10张取蜡带贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，用于免疫组织化学染色。

1.3 定量分析

1.3.1 免疫组织化学染色及定量分析：采用SP免疫组织化学染色法观察海马神经元Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。一抗为兔抗，稀释浓度Bcl-2为1∶50、Bax为1∶100，用PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞内出现棕黄色颗粒弥漫分布为阳性反应。DAB显色，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，Olympus光学显微镜下观察，并摄片。采用MiVnt图像分析系统对免疫组织化学阳性结果进行定量分析。于海马CA2区任取3个视野（10×20），计算阳性产物占视野面积的百分比。每例标本选取5张切片，每张切片选取3个视野，取平均值。

1.3.2 微血管构筑定量分析：每例标本于海马水平部平面分别随机选取5张单宁酸-氯化铁染色切片，每张切片在显微镜下（10×10）根据海马分区分别在CA1、CA2、CA3及CA4区各选取1个视野。采用Mi-Vnt图像分析系统对海马各区的微血管密度（microvessel density，MVD）和微血管面积（micorvessel area，MVA）进行定量分析。取海马CA1、CA2、CA3及CA4区的MVD平均值作为海马水平部MVD值；取海马CA1、CA2、CA3及CA4区的MVA平均值作为海马水平部的MVA值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 硫堇染色结果

假手术组大鼠海马各区神经元排列紧密，神经元胞体较大，细胞核大而圆，核仁清晰。实验组大鼠海马神经元密度降低、排列松散，神经元胞体缩小、大小不规则、细胞周间隙增宽，部分细胞固缩深染，细胞核固缩、部分细胞核仁消失；且随缺血时间的延长，这种变化逐渐加剧（图1）。

2.2 海马神经元Bcl-2蛋白表达的动态变化

Bcl-2蛋白免疫反应阳性产物呈棕黄色细腻颗粒状，位于细胞质；海马水平部各区均可见Bcl-2蛋白的表达，以CA2区居多。与假手术组大鼠相比，实验组大鼠海马神经元Bcl-2蛋白的表达明显减少（P＜0.05，表1）；且随缺血时间的延长，Bcl-2蛋白的表达逐渐下调，其中21 d实验组明显低于与7 d实验组（P＜0.05，图2）。

2.3 海马神经元Bax蛋白表达的动态变化

Bax免疫反应阳性产物呈棕黄色粗颗粒状，位于细胞质，海马水平部各区均可见Bax蛋白的表达，以CA2区居多。与假手术组大鼠相比，实验组大鼠海马神经元Bax蛋白的表达明显增多（P＜0.05，表1）；且随缺血时间的延长，Bax蛋白的表达逐渐上调，其中21 d实验组明显高于7 d和14 d实验组（P＜0.05，图3）。

2.4 海马微血管的形态变化

光镜下观察，可见假手术组中进入海马裂的小动脉首先分出数支横行动脉，再由横行动脉发出分支，分布于海马裂两侧的海马水平部各区。在水平部各区内微血管分布密集，相互吻合成网，但与周围脑组织的血管之间吻合较少（图4A）。实验组大鼠海马水平部微血管显著减少，分布杂乱，血管之间的吻合较少；并且随着造模时间的延长，微血管数量逐渐减少（图4B、4C）。

定量分析结果显示：实验组各时间点大鼠海马的MVA和MVD均较假手术组明显下降（P＜0.05，表2）。随着造模时间的延长MVA和MVD逐渐下降，14 d实验组及21 d实验组的MVA和MVD明显低于7 d实验组（P＜0.05），且21 d实验组与14 d实验组相比MVA的差异无统计学意义（P＞0.05），但21 d实验组的MVD明显低于14 d实验组（P＜0.05）。

3 讨论

血管性痴呆早期的核心症状是记忆功能减退，而海马是大脑近期记忆环路（海马—穹窿—乳头体—丘脑前核—扣带回）的主要结构，是学习和记忆功能的重要结构基础。同时，海马也是脑缺血时极易受损的一个脑区，对缺血、缺氧极为敏感。SD大鼠基底动脉环完整，因此结扎双侧颈总动脉可以有效的减少脉络膜动脉和大脑后动脉的血供，降低大鼠脑组织的血流灌注，又可以避免脑组织由于完全缺血导致的损伤。脉络膜动脉和大脑后动脉是大鼠海马主要血供来源，两者均来源于颈内动脉，海马水平部的营养主要来源于脉络膜动脉分支，该动脉由颈内动脉脑底段发出，进入海马裂后分出数支横行动脉，再由横行动脉发出分支分布于海马裂两侧的海马水平部各区［9］。

本研究发现：海马水平部各区内毛细血管相互吻合成网，但与周围脑组织的血管之间吻合较少，海马区脑组织很难通过侧支循环获得血液供应，因此结扎双侧颈总动脉会导致海马区脑组织血供出现大幅度的下降。表现为慢性脑缺血实验组各时间点大鼠海马的MVA和MVD均较假手术组明显下降。并且随着缺血时间的延长，缺血、缺氧损伤导致海马微血管内微栓塞形成增加、微血管平滑肌收缩、微血管管腔闭塞，微血管功能进一步下降［10，11］，所以随着造模时间的延长，大鼠海马的MVA和MVD表现为进行性降低。

Bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，可通过抑制细胞内质网中钙离子释放、作为氧自由基拮抗剂等多种途径抑制细胞凋亡［12，13］。Xue等［14］报道Bcl-2蛋白能减少海马组织缺血后的神经元凋亡。Bax为细胞凋亡促进因子，高表达的Bax蛋白可互相结合形成同源二聚体，诱导和促进细胞凋亡。

本研究显示，慢性脑缺血模型大鼠海马神经元Bcl-2蛋白的表达明显降低，Bax蛋白的表达明显升高，并且这种变化随缺血时间的延长逐步加剧。结合其微血管构筑的变化考虑：慢性脑缺血时大鼠海马血流量大幅度下降，缺血、缺氧导致的氧自由基毒性增高、细胞内钙离子超载、谷氨酸的兴奋毒性等引起海马神经元凋亡增加。随着缺血损伤时间的延长，微循环功能进一步降低，神经元的凋亡逐渐增加。

本研究表明，慢性脑缺血大鼠模型建立21 d内，缺血性损伤显著降低海马微血管功能、增加海马神经元凋亡，且随缺血时间的延长，这种变化逐渐加剧，进而导致学习和记忆功能障碍逐渐加重。

［1］高风超，陈翔，田新英.血管性痴呆危险因素及发病机制的研究进展［J］.医学综述，2014，20（6）：1068-1071.

［2］Bonini JS，Da Silva WC，Bevilaqua LR，et al.On the participation of hippocampal PKC in acquisition，consolidation and reconsolidation of spatial memory［J］.Neuroscience，2007，147（1）：37-45.

［3］Li S，Guo L，Huang L，et al.Behavioral alterations associated with a down regulation of HCN1 mRNA in hippocampal cornus ammon 1 region and neocortex after chronic incomplete global cerebral ischemia in rats［J］.Neuroscience，2010，165（3）：654-661.

［4］Jia H，Zhang XM，Zhang BA，et a1.Dendritic morphology of neurons in medial prefrontal cortex and hippocampus in 2VO rats［J］.Neurol Sci，2012，33（5）：1063-1070.

［5］张小乔，李鹂，马国平.重复经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马锥体细胞树突形态的影响［J］.中华物理医学与康复杂志，2014，36（1）：2-6.

［6］范文辉，刘之荣，李露斯.血管性痴呆的动物模型及其胆碱能机制研究［J］.第三军医大学学报，2000，22（4）：314-316.

［7］严芳，王宇卉.血管性认知功能损害的病理机制与预防［J］.世界临床药物，2014，35（7）：390-393.

［8］赵淑敏，孔祥玉.一种媒染微学管的新方法——单宁酸氯化铁法［J］.解剖学杂志，2001，24（1）：91-92.

［9］谢红林，杨振军，郭森.大鼠海马微血管构筑的定量分析及衰老变化［J］.解剖学杂志，2008，31（1）：77-79.

［10］唐民科，冯卫红，徐秋萍.脑缺血后的脑微血管变化［J］.生理科学进展，2006，37（3）：236-238.

［11］郭晓谨，李兴广，李卫红.三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2014，20（2）：215-216.

［12］孙晓红，孟秀君，徐枫.米氮平对抑郁症大鼠海马凋亡相关蛋白表达的调节作用［J］.中国医科大学学报，2012，41（1）：8-10.

［13］王岩峰，秦光华，杨明超.高压氧对大鼠脊髓损伤后Bcl-2表达的影响［J］.中国医科大学学报，2013，42（4）：293-300.

［14］Xue H，Jin L，Jin L，et al.Neuroprotection of aucubin in primary diabetic encephalopathy［J］.Sci China C Life Sci，2008，51（6）：495-502.

（编辑 陈 姜）

Correlation Study between the Time of Chronic Cerebral Ischemia and Hippocampal Neuron Apoptosis in Rats

YANGZhen-jun1，SHIChang-qian2，XUE Jing-feng1
（1.Department of Human Anatomy，Chengde Medical College，Chengde 067000，China；2.President′s Office，Dalian Branch of Liaoning Armed Police Corps Hospital，Dalian 116013，China）

ObjectiveTo investigate the effects of the chronic cerebral ischemia on the rats′hippocampal neurons，and to explore its mechanism.MethodsA total of90 healthy，adult male SD rats were applied in this study and randomly divided into sham operation group（n=30）and experimental group（n=60）.The rats in both groups were respectively sacrificed 7-day，14-day and 21-day after operation，with each time point of 10 from sham operation group and 20 from experimental group.The chronic cerebral ischemia rats model were established by permanently ligating the common carotid arteries on both sides of rats，as experimental group.Sham operation group were established by incise cervical median，only separated common carotid arteries on both sides，not ligated.Thionine staining was used to observe the morphological changes of hippocampus neurons.Immunohistochemistry staining was used to observe dynamic changes of expression of Bcl-2 and Bax in hippocampusneurons，and MiVnt image analytical system to quantitatively analyze the results.TA-FE method was used to detect the dynamic changes of hippocampal microvascualr architecture. MiVnt image analytical system to quantitatively analyze the microvessel density（MVD）and micorvessel area density（MVA）of horizontal part of hippocampus.ResultsCompared with sham operation group at the same time point，the Bcl-2 expression in hippocampus neurons of experimental group were significantly lower（P＜0.05），and with time extension，the Bcl-2 expression gradually decreased.The Bcl-2 expression in 21-day experimental group were significantly lower than 7-day experimental group（P＜0.05）.Compared with sham operation group at the same time point，the Bax expression in hippocampus neurons of experimental group were significantly higher（P＜0.05），and with time extension，the Bax expression gradually increased.The Bax expression in 21-day experimental group were significantly higher than 7-day and 14-day experimental group（P＜0.05）.The MVD and MVA of hippocampus of experimental group at each time point were obviously decreased compared with sham operation group（P＜0.05）.The MVA and MVD gradually decreased with time extension，the MVA and MVD of hippocampus of 21-day and 14-day experimentalgroupsignificantly decreased compared with 7-day experimental group（P＜0.05）.The MVD of hippocampus of21-day experimental group obviously decreased compared with 14-day experimental group（P＜0.05）.ConclusionChronic cerebral ischemia can up-regulate the Bcl-2 expression，decrease the MVD and MVA of hippocampus progressive，increase Bax expression，which may cause learning and memory dysfunction aggravated gradually.This mightbe one reason of vascular dementia.

chronic cerebral ischemia；hippocampus；Bcl-2；Bax；microvascular architecture

R74

A

0258-4646（2015）01-0055-05

河北省科技厅计划支持项目（13277772D）

：杨振军（1976-），女，副教授，硕士.

薛景凤，E-mail：xjf@cdma.edu.com

2014-09-22

网络出版时间：