基质金属蛋白酶-2、14及RECK基因在涎腺多形性腺瘤的初发、复发及恶变中的表达及意义

阿依努尔·艾比布拉，尹小朋，龚忠诚，刘 慧，凌 彬，克热木·阿巴斯，胡露露，宁晓婷，杨 萌，陈青立，林兆全

（新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科新疆医科大学口腔医学院新疆维吾尔自治区口腔医学研究所新疆乌鲁木齐830054）

基质金属蛋白酶-2、14及RECK基因在涎腺多形性腺瘤的初发、复发及恶变中的表达及意义

阿依努尔·艾比布拉，尹小朋，龚忠诚，刘 慧，凌 彬，克热木·阿巴斯，胡露露，宁晓婷，杨 萌，陈青立，林兆全

（新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科新疆医科大学口腔医学院新疆维吾尔自治区口腔医学研究所新疆乌鲁木齐830054）

目的：研究基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-14（matrix metalloproteinase 14，MMP-14）和RECK基因在涎腺多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）初发患者、复发患者及进一步恶变患者组中的表达及其意义。方法：研究对象为新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科2004年至2014涎腺PA手术标本50例，其中初发36例，恶变7例，复发7例和10例正常腮腺组织（10例均来自腮腺）。通过免疫组织化学方法检测RECK、MMP-2和MMP-14在各组标本中的表达，并采用半定量方法进行计量。对RECK与MMP-2及MMP-14在各组中的表达采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：MMP-2在正常组与复发组差异有统计学意义（P＜0.05），正常组与恶变组差异有统计学意义（P＜0.05），初发组与复发组差异有统计学意义（P＜0.05），初发组与恶变组差异有统计学意义（P＜0.05）。RECK与MMP-2和MMP-14在各个组的表达都呈负相关（r=-0.887，P＜0.05；r=-0.798，P＜0.05）。结论：临床上，在涎腺PA恶变，复发组织同时对RECK与MMP-2的进行检测分析其有重要意义，这对于判别肿瘤侵蚀性和预后指标是极有可能。

涎腺；多形性腺瘤；MMP-2；MMP-14；RECK；免疫组化

多形性腺瘤（pleomorphic adenoma，PA）是涎腺肿瘤中临床常见的，在好发部位中，腮腺不但是其中最主要，也是最经常见的，复发和有恶变的可能性较大，然而，这个部位发生、复发和恶变的机理都还缺乏清晰的认识。在恶性肿瘤的侵蚀和转移中，施展重要作用的是基质金属蛋白酶类（Matrix metalloproteinases，MMPs），在MMPs家族中，MMP-2和MMP-14是较为重要的的成员，它可以通过降解细胞外基质，紧接着破害机体抵抗肿瘤浸润与转移的能力，进而使得肿瘤的浸润性增加［1］。基底膜也起着相同的作用。半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）是一种肿瘤抑制基因，是一类抑制剂，起着特殊的抑制基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）活性的作用，可以在转录后水平抑制多种MMPs的表达能力［2］。本实验利用免疫组化方法，通过检测正常腮腺组织、涎腺PA初发患者、复发患者和恶变患者组织中RECK与MMP-14和MMP-2中的表达，对比其表达意义，为临床判别肿瘤的侵袭性和预后提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

材料来源于2014年度新疆医科大学第一附属医院颌面外科腮腺多形性腺瘤（来自腮腺来源）手术切除标本50例，其中包括初发36例，恶变7例，复发7例和10例正常腮腺组织（10例均来自腮腺）本次实验所用标本都未经术前化疗，放疗史的标本组织也经病理证实。研究所用人的离体标本，都通过了新疆医科大学伦理审查委员会审批，50例患者都同意此次实验，还签订了知情同意书。实验中所有标本组织均采用10%福尔马林固定，并用常规石蜡包埋，4μm厚度连续切片。

1.2 方法

以PBS代替一抗作为阴性对照，以舌癌组织切片作为阳性对照。采用免疫组化SP染色法对指标的表达进行验证。

1.2.1 试剂：兔抗MMP-14单克隆抗体；兔抗基质金属蛋白酶-2单克隆抗体；鼠抗人RECK单克隆抗体（1: 100）；DAB显色试剂盒（上述实验试剂均购自博士德生物、博奥森及北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2.2 设备：37℃恒温孵育箱；4℃冰箱；-20℃冰箱；烘箱；切片机；双目显微镜及BH-2显微照相系统。

1.2.3 实验方法和步骤：①将切好的片子，52℃烘箱中烘烤过夜；②脱蜡、水化：脱蜡前，将片子于室温中放置60min，然后双蒸水洗片子，5min/次，共3次；③去除内源性过氧化物酶，3%双氧水室温孵育10min；④双蒸水冲洗片子，PBS将其浸泡5min；⑤0.01mol/L构橼酸缓冲液（pH=6.1）微波抗原修复10min，室温冷却，蒸馏水冲洗，PBS浸泡；⑥37℃孵育片子15min，然后甩干；⑦滴加RECK、MMP-2或MMP-14一抗稀释液，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，3min×3次，每个期以PBS液替代一抗；⑧将生物素化二抗液滴加于片子上，37℃恒温烘箱孵育25min；⑨用PBS冲洗切片，3min×3次；⑩DAB显色剂显色切片；⑪自来水滴于片子上，用于终止显色；⑫苏木素复染切片5min，双蒸水冲洗切片，盐酸乙酸分化返蓝、脱水；⑬烘干切片，中性树胶封片、显微镜观察目标蛋白的表达。

1.2.4 结果判定：RECK、MMP-14、MMP-2的着色部位在细胞质。400倍镜下观察细胞数，取5个视野数细胞数，并计算阳性细胞与总细胞数的比值。观察过程中，阳性反应是细胞核或细胞浆内出现较为明显的棕黄色或者棕褐色颗粒为准，并且要求背景干净。阳性分级标准：阴性（-）：＜10%，弱阳性（+）：≥10%，阳性（++）：≥30%，强阳性（+++）：≥50%。

1.2.5 统计学分析：采用Excel输入数据，SPSS21.0统计软件包对结果来进行统计学分析。对于有序的等级资料，采用Ridit分析方法，并将其进行特定的转化，变成连续型资料（R值）：将转换后的数据进行单因素方差分析的F检验，分析正常、初发、复发、恶变四组总体上是否有统计学意义，四组间的两两比较采用LSD检验；当F值无意义时，则不进行组间两两比较。统计水准设定为0.05，P＞0.05表明差异无统计学意义。

2 结果

2.1 Ridit分析结果

从表1可知，本实验将实验组分别与标准组（0.5）相比，比较前提是把R均值看成是MMP-2的评价指标，复发组与恶变组的可信区间包含0.5，表明复发组与恶变组的MMP-2表达与标准组无统计学意义。从总体上看，F=3.658，P＜0.05，可以从总体上认为四组中MMP-2在的阳性表达率比较差异具有统计学意义。剩余两组有统计学意义。其中初发组结果为0.36，比正常组高。通过两两比较发现正常组与复发组差异有统计学意义（P＜0.05），正常组与恶变组差异有统计学意义（P＜0.05），初发组与复发组差异有统计学意义（P＜0.05），初发组与恶变组差异有统计学意义（P＜0.05）。从图1可以直观的看出正常组与初发组的均值明显小于复发和恶变组；而正常组和初发组相近，复发组与恶变组相近。

2.2 从表2可以看出，本实验把R均值看作是MMP-14的评价指标，其余几组分别与标准组（0.5）相比较，四组可信区间均包含0.5，表明四组MMP-14表达与标准组均无统计学意义。根据4组比较F=2.205，P=0.098，大于0.05，可以认为MMP-14在四组的阳性表达率差别无统计学意义。

2.3 以R均值作为RECK的评价指标，各组分别与标准组（0.5）相比，正常组与恶变组的可信区间不包含0.5，表明正常组与恶变组的RECK表达与标准组相比，差异有统计学意义。其余2组均无统计学意义。从表3可知，正常组RECK表达最高为0.78，恶变组最低为0.26。根据4组比较F=7.177，P＜0.05，说明通过比较四组中RECK的阳性表达率，差别具有统计学意义。两两比较发现正常组与初组、复发组、恶变组差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。从图3可以直观的看出正常组与恶变组的均值有明显差异；而复发组和初发组相近。

2.4 相关性分析

由表4、表5可知，Spearman分析结果表明，正常腮腺、涎腺PA初发、复发、恶变组织中，RECK的阳性表达率与MMP-2和MMP-14的阳性表达率均呈负相关（r=-0.887，P＜0.05；r=-0.798，P＜0.05）。

3 讨论

本次研究选取新疆医科大学第一附属医院PA手术患者，总共手机标本50例。涎腺多形性腺瘤初发患者、复发患者、恶变患者的组织都包含在内，实验结果较有代表性和说服力。

统计结果表明MMP-2在正常腮腺组织、PA复发、初发及恶变标本中表达呈区组性，表现为复发和恶变组MMP-2高于正常和初发组。目前认为，MMPs能在肿瘤浸润转移中受到重视［3］，原因是能降解ECM的蛋白成分，破坏肿瘤细胞的侵袭，同时促进肿瘤血管新生，促进肿瘤的生长和扩散［4］。本次实验显示，MMP-2蛋白在复发和恶变组的表达明显高于正常和初发组，说明MMP-2参与肿瘤向外浸润、扩展的过程。国外学者在MMP-2在乳腺癌表达时也证明这一观点［5-6］。

MMP-14属于膜型MMPs。综合最新研究表明其在肿瘤浸润转移的作用主要表现为：①降解细胞外基质；②激活MMP-2酶源，可以认为是水解的放大作用；③以细胞间粘附分子的桥梁，可以影响细胞的迁徙［7］；④促进血管形成。有学者研究表明MMP-14可以调节VEGF的表达，促进内皮细胞的转移［8］。多种肿瘤组织中均有MMP-14蛋白及mRNA的表达结果呈阳性，说明其表达相对于正常组织是过量的，且其与MMP-2的表达呈协同作用，表明这两种蛋白共同对肿瘤的发生、发展起着促进作用［9-13］。本研究中，MMP-14在各组中差异无统计学意义，笔者对这此结果保持审视态度，不对MMP-14的临床检查意义下否定结论，出现此种情况可能与正常组和初发组样本数在总样本数所占比例较高有关。

1998年日本学者Takahashi等发现的一种新的基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂--RECK基因。它是由v-Ki-ras基因转染到小鼠的纤维原细胞（NIH/ 3T3），经过克隆得到［14］。RECK的作用主要可以归纳为两方面：①抑制肿瘤转移和侵袭；②抑制血管表达［15］。Akira等的研究表明RECK可抑制MMP-2和MMP-7介导的纤维结合蛋白的降解［16］。Norihir等在对肺癌患者的研究表明RECK的表达与癌症浸润呈正相关关系，由此可以得出的结论是RECK通过抑制基质金属蛋白酶来使得癌症转移［17］。RECK基因表达抑制血管生成的研究中，Takeuchi等证实RECK基因能阻碍血管内皮因子的表达，但这种情况只有在内皮血管生长因子高度表达时才得以体现［18］。本次研究表明RECK在正常组的表达明显高于其他各组，而恶变组的表达低于正常、初发组。在相关关系上，RECK基因表达与MMP-2和MMP-14呈反比，可以推测RECK基因可抑制MMP-2和MMP-14的表达。

综合以上，笔者可以认为，临床上，在涎腺PA恶变，复发组织同时对RECK与MMP-2的进行检测分析其有重要意义，这对于判别肿瘤侵蚀性和预后指标是极有可能。

［1］龙华，周波.MMP-2和MMP-14在视网膜母细胞瘤中表达及意义［J］.国际眼科杂志，2011，11（10）:1719-1721.

［2］Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al.RECK--a newlydiscovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26（3-4）:675-683.

［3］Sledge GW.Implications of the new biology for the rapy in breast cancer［J］.Semin Oncol，1996，23（1 Suppl2）:76-81.

［4］Basset P，Okada A，Chenard MP.Matalloproteinase as stromaleffectors of human carcinoma progression: therapeutic implications［J］.Matrix Bio，1997，15（8-9）：535-540.

［5］Ones JL，Glynn P，Walker RA.Expression of MMP-2 and MMP-9.Their inhibit ors，and the activator MTI-MMP in primary breast carcinomas［J］.Pathol，1999，189（2）:161-168.

［6］Nakopoulou L，Tsirmpa I，Alexandrou P，et al.MMP-2 protein in invasive breast cancer and the impact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall survival［J］.Breast Cancer Res Treat，2003，77（2）:145-155.

［7］胡兴胜，文世民，邹心怡，等.MMP14在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系［J］.生命科学研究，2012，16（4）:329-332.

［8］B0rrirukwanit K，Lafleur MA，Mercurif A，et al.The type 1 collagen induction of MT1-MMP-mediated MMP-2 activation is repreased by alpha Vbeta3 integrin in human breast cancer cells［J］.Matrix Biology，2007，26（4）291-305.

［9］Nawrocki B，Polette M，Marchand V，et al.Expression of matrix mataIIoproteinase and their inhibitors in human bronchopulmonary carcinomas：Quantificative and morphological analysis［J］.Int J Cancer，1997，72：556-564.

［10］Mori M，Mimori K，ShIraishi T，et al.Analysis of MTl-MMP and MMP-2 expression in human gastric cancers［J］.Int J Cancer，1997，74：316-321.

［11］Ellenrieder V，AIber B，Lacher U，et al.Role of MT-MMPs and MMP-2 in pancreatic cancer progression［J］.Int J Cancer，2000，85:14-20.

［12］Nakamura H，Ueno H，Yamashita K，et al.Enhanced production and activation of progeIatinase A mediated by membrane-type1 matrix metalloproteinase in human papillary thyroid carcinomas［J］.Cancer Res，1999，59：463-467.

［13］Sakakibara M，Koizumi S，Saikawa Y，et aI.Membranetype matrix metalloproleinase-1 expression and activation of gelatinise A as prognostic markers in advanced pediatric neuroblastoma［J］.Cancer，1 999，85:231-239.

［14］Makoto N，Junseo O，Rei T，et al.RECK:A novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellular matrix remodeling［J］.Cancer Metastasis Res，2003，22（23）：167-175.

［15］张杰，颜虹.RECK基因在恶性肿瘤浸润和转移中作用的研究进展［J］.陕西医学杂志，2011，6（40）:732-734.

［16］Akira O，Tomoko M，Kazuhiro M，et al.RECK Forms Cowbell-shaped Dimers and Inhibits Matrix Metalloproteinase-catalyzed Cleavage of Fibronectin［J］. Bio Chem，2009，284（6）:3461-3469.

［17］Norihiro T，Mitsuhiro T，Yasuhiro H，et al.Lowexpression of reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs（RECK）indicates a shorte survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung［J］.Lung Cancer，2007，58:376-383.

［18］Taku T，Michiyoshi H，Mitsuo N，et al.The membrane anchored matrix metalloproteinase regulator RECK in combination with MMP-9 serves as an informative prognostic indicator for colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10（8）：5572-5579.

Expression of RECK Gene and Matrix Metalloproteinase-2，Matrix Metalloproteinase-14 in the Primary Plemorphic Adenoma（PA），Recurrent PA and Malignant PA

Ayinuer Aibibula，YIN Xiao-peng，GONG Zhong-cheng，LIU Hui，LING Bin，Keremu Abass，HU Lu-lu，NING Xiao-ting，YANG Meng，CHEN Qing-li，LIN Zhao-quan
（Department of Oral&Maxillofacial Oncology Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Stomatology College of Xinjiang Medical University，Stomatology Research Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the expression and significance of RECK gene and Matrix Metalloproteinase-2（MMP-2），Matrix Metalloproteinase-14（MMP-14）in the primary plemorphic adenoma（PA），recurrent PA and malignant PA.Methods Fifty samples including 36 primary PA，7 recurrent PA，7 malignant PA and 10 normal parotid glands as control were examined immunohistocheemically.Among the 10 PA samples，there were all samples originated from parotid gland.RECK gene，MMP-2 and MMP-14 were decected immunohistochemically and semi-quantitively in these samples.All date were analyzed through SPSS 21.0 software.Results MMP-2 has significant difference in normal group and recurrent group（P＜0.05），the difference was statistically significant in normal group and the malignant group（P＜0.05）；the difference was statistically significant in primary group and recurrent group（P＜0.05）；the difference was statistically significant in primary group and the malignant group（P＜0.05）.The expression of RECK and MMP-2 and MMP-14 were negative correlation，respectively，in normal parotid gland，primaryPA，recurrent PA and maligant PA（r=-0.887，P＜0.05；r=0.798，P＜0.05）.Conclusion Clinically，in the tissue of the salivary glands，PA will relapse.When examined both RECK and MMP-2 have significant meaning.Through this examination，tumor aggressiveness and prognosis can be indicated.

Salivary glands；Pleomorphic adenoma；MMP-2；MMP-14；RECK；Immunohistochemisty

R739.8

A

1008-6455（2015）05-0040-07

2015-01-26

2015-03-23

编辑/张惠娟

新疆医科大学第一附医院自然科学青年基金（编号：2013ZRQN36），名称：RECK基因与MMPs在涎腺多形性腺瘤复发及恶变中的表达及其意义

龚忠诚，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，邮编：830054；E-mail:gump0904@aliyun.com