宏基因组学在口腔微生物研究中的应用进展*

车宇薇 王燕一

口腔是人体非常重要的微生态环境之一。口腔具有复杂的解剖结构和特殊的生理特点，在口腔中定植着繁复的微生物群落。在口腔庞大微生物组中仅有小部分可以培养，传统的细菌培养技术很大程度上局限了口腔微生物组的研究。宏基因组学技术通过高通量测序获得样本的所有目标基因序列进行分析，可以直接从基因水平研究口腔微生物。该技术一方面可进行微生物生态学的研究，从微生物群落角度研究口腔微生物的多样性及其变化；另一方面可进行口腔微生物基因组学的研究，并从中分析筛选新的功能基因及其产物。技术的发展为口腔微生物群落研究提供了手段，使口腔微生物群落与口腔、全身的疾病与健康关系的研究更加深入。

1. 宏基因组研究简介

宏基因组(Metagenome)是指微生态环境中全部微生物遗传物质的总和，包括可以进行培养的和现阶段尚不能培养的微生物基因组。宏基因组学(Metagenomics)是以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物群基因组为研究对象，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及微生物与环境的关系为研究目的的新的微生物研究方法[1]。宏基因组学的研究主要是是从环境样本中提取DNA 或RNA，进行大规模测序，其主要策略如下：(1)采用引物PCR 技术扩增16S rDNA(主要是V6 区)、16S rRNA 或其他遗传标记，然后对扩增产物测序(Amplicon sequencing)；(2)构建宏基因组文库，然后进行克隆测序(Clone sequencing)、生物活性水平筛选(即功能驱动筛选，Function driven screening)、 序 列 驱 动 筛 选(Sequence driven screening)或底物诱导基因表达筛选(Substrateinduced geneexpression screening，SIGEX)；(3)直接进行鸟枪法测序。对测序产生的大量数据，借助于生物信息学分析方法和具有数据组装、基因预测、物种分类鉴定、功能注释等功能的计算系统及软件平台进行分析。通过分析可发现大量曾经未能获得的未知微生物新基因或新的基因簇，从而对环境样本微生物群落及其代谢功能进行深入的研究分析[2]。

2. 宏基因组学在口腔医学中的应用

2.1 口腔微生物的研究方法 人类体内有多于人体自身细胞数目数倍的微生物[3]。这些微生物中绝大部分在人正常的生理功能中发挥作用，如参与营养物质的吸收，维生素的合成和机体防御。口腔是人体微生物定植生存的重要生态区域之一，适宜的温度、湿度，复杂的结构和丰富的营养来源，为口腔内各种微生物的生长和定植提供了环境，从而也造就了口腔微生物群落丰富的多样性[4]。现阶段可鉴定出人类口腔寄居着500-700 种细菌[5]。1924 年J.K.Clarke 首次于口腔中分离出变形链球菌，此后对口腔微生物的认识主要通过传统的分离培养方法。但环境中可培养的细菌小于1%，故采用菌斑指示剂和传统培养方法研究口腔微生态有很大的局限性[6]。

随着分子遗传学和分子生物学技术的发展，陆续出现了一系列不依赖于传统培养技术的分子检测手段，如：16S rRNA 克隆测序、聚合酶链式反应-变性/ 温度梯度凝胶电泳(PCR-DGGE/ TGGE)、末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)、聚合酶链式反应-变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)、DNA 杂交技术等等[7]。这些技术应用对临床工作的指导和决策有重要意义，但通常只能对环境中的优势菌群进行检测分析，检测精度及分辨率有限，在某种程度上不能完整的反映整个口腔微生物群落的组成和动态变化。

2005 年诞生的454 和Solexa 新一代测序技术标志着快速基因组测序时代的到来，以合成测序为核心的第二代测序技术和高通量基因芯片的出现是对传统技术的革新[8，9]，分子生物学和分子遗传学技术的发展催生了宏基因组学这门崭新的交叉学科。宏基因组学技术的应用为土壤环境、海洋环境及人类胃肠等的微生物种群的研究提供了崭新的视角，同时也翻开了口腔微生物研究的新篇章。2008 年美国福塞斯研究所和英国国王学院联合建立了人类口腔微生物组数据库(HOMD，http:/ / www.homd.org)。该数据库提供了人类口腔中约700 种原核生物种系的全面信息，记录了13 个门目口腔微生物分类群的发育树、基因组和16S rRNA 的信息。随后的研究不断丰富了这一成果：Keijser等[10]发现口腔微生物涵盖22 个门318 属，其中菌斑267 属，约10000 个种系型，唾液185 属，约5600 个种系型；Nasidze 等[11]还在唾液中发现了64个未知细菌种属；A. Murat Eren 等[12]利用寡核苷酸配型分析口腔菌群微生物，第一次实现在亚种水平进行高分辨率的细菌分类。2010 年Ghannoum等[13]在人类口腔中检测出85 种真菌属，其中11 种尚未被培养。Willner 等[14]利用宏基因组学技术手段，首次分离并鉴定出了口腔DNA 病毒组。宏基因组学的不断发展为研究口腔微生物的多样性和复杂的群落结构提供了重要的技术支撑。

2.2 宏基因组学在口腔微生物群落研究中的应用 在传统的细菌培养和显微镜检测技术时代，变异链球菌和乳杆菌等被认为是引起龋病的主要致病菌。随着宏基因组学技术的应用，龋病的相关研究进一步深入。Aas 等[15]发现龋病发展的不同阶段以及恒牙与乳牙龋之间的细菌图谱分布存在显著差异，且在能检测到变异链球菌的个体中，其他菌属诸如奇异菌属、丙酸菌属以及乳酸菌属也有较高的表达，除变异链球菌属之外，韦荣菌属、乳酸菌属、放线菌属、双歧杆菌属、低pH 的非变异链球菌属、丙酸菌属以及奇异菌属都与龋病的发生发展息息相关。Hughes CV.等[16]对于儿童早期龋的研究发现远源链球菌和耐酸细菌与严重的儿童早期龋相关，远源链球菌而非变形链球菌在继发龋中比例和数目远高于无继发龋组。Peterson SN 等[17]对未患龋和龋活跃儿童的乳牙列牙菌斑样本进行16S rDNA 测序，分析鉴定出了约1372 个操作分类单元(OTU)，近一半的OTUs 在患龋与未患龋的牙菌斑微生物组中都很常见，且呈现了相似的丰度。两组间的差异并非特定微生物种群的质的不同，而是微生物特定种系型的量的改变。Li Y 等[18]的研究求分析发现，成人龋活跃人群和健康人群唾液样品中无龋健康人群有更高的菌种多样性，这一结果提示一部分口腔细菌可能在在龋活跃人群中出现缺失、被替换或者抑制。

宏基因组学技术也被应用于牙周相关疾病的研究，使复杂的牙周疾病的研究进一步发展。Wang JF 等[19]对9 名健康人和7 名牙周炎患者的样本宏基因组测序后发现健康人菌斑和口腔环境中的微生物菌属主要为链球菌属、嗜血杆菌属、罗氏菌属和嗜二氧化碳纤维菌属，占全部菌种的90%以上。而牙周炎患者口腔的微生物有更丰富的多样性，其拟杆菌、放线菌、变形菌和厚壁菌属丰度远高于健康人。从基因的角度分析，在牙周炎患者中LPS 和PrtC 基因明显增多，而细菌的合成代谢和分解代谢显著降低，如编码参与代谢硫和过氧化物的酶的基因严重不足。种植体周围炎是导致种植体失败的主要原因，其与牙周炎有类似的临床表现，两者之间可能存在一定关联[20-22]。Kumar PS 等[23]研究发现，种植体周围炎生物膜的多样性远低于正常和牙周病状态下的龈下生物膜。种植体周围炎的优势菌属是：丁酸弧菌属、弯曲杆菌属、真细菌属、普氏菌属、新月形单胞菌属、链球菌属、放线菌属、纤毛菌属、丙酸菌属、消化球菌属、乳酸球菌属和密螺旋体属。种植体周围炎与正常种植体周围相比有较低水平的普氏菌和纤毛菌属，但放线菌、消化球菌、弯曲杆菌，非变异链球菌、丁酸弧菌和变异链球菌较高。由此表明种植体周围炎是一种主要有革兰氏阴性致病菌引起的特异性感染，其微生物群落构成远没有牙周病复杂。

此外，Faust K 等[24]研究了口腔、胃肠、阴道等人体不同位置微生物群落间的共现情况，结果表明虽然大多数的微生物群落在全身不同部位没有关联，但有一小部分微生物(如厚壁菌属等)如同各群落间的联络员，搭建起了全身的关联，协调人体的整个微生物群体。以上观点从微生物的角度验证了口腔疾病与全身疾病存在潜在关联。Willner 等[14]对健康人口咽部的病毒进行高通量测序技术检测，发现了可编码血小板凝集因子PblA 和PblB 的，寄生于变异链球菌中的噬菌体sm-1 基因。Nakano K 等[25，26]学者也曾在心内膜上发现了变异链球菌，以上结果表明口腔中寄生于变异链球菌的病毒与心脏疾病可能存在联系。

2.3 宏基因组学在口腔微生物新型功能基因筛选中的应用 宏基因组学技术除了能帮助我们研究微生物种群的结构及其功能外，还可以用于发现新的基因和研发新的微生物活性物质。Xie G 等[27]利用第二代高通量宏基因组测序技术检测健康人的牙菌斑，产生了约860，000，000 对非人类来源的基因片段。其中，约有73%能够编码蛋白质，约有2.8%基因序列编码与抗生素耐药相关的蛋白质，表明口腔微生物群落是研究抗生素耐药性重要的基因库。2003 年Diaz-Torres 等[28]采集了人类唾液标本，通过构建人类唾液宏基因组文库，筛选出一种未曾获得的四环素耐药基因tet(37)。吴丹等[29]提取牙菌斑进行宏基因组测序，构建Fosmid 文库，其后用卡那霉素、四环素及氨苄西林进行筛选，筛选得到了一个氨基糖苷类双功能修饰酶AacAAphD 基因、一个核糖体保护蛋白型四环素耐药基因tet(M)和一个C 家族β-内酰胺酶基因。这一实验研究证实了宏基因组学技术可用于检测筛选牙菌斑菌群中的抗生素耐药基因。目前对于口腔微生物新的功能基因及其相关功能的研究还较少，在宏基因组学技术的辅助下，该领域的研究有很大的发展空间。

3. 结语

目前对口腔微生物的研究大部分仍局限于实验室可培养的菌种，利用宏基因组学技术研究口腔微生物多样性和生物群落的功能代谢是必然趋势。宏基因组学技术使我们能够更深入的理解口腔微生物组成、结构和功能，以及口腔和全身的健康与疾病的关系。目前临床常见的诊断和检测全身疾病的方法，如内镜检查，血液检查等均会对人体造成一定程度的损伤。利用宏基因组学研究方法，对口腔菌斑样本或者唾液样本中的菌群组成的动态监控，可成为对人类健康状况评估的一种新的非损伤性方法。技术的不断发展为口腔微生物的研究提供了崭新的舞台，我们正面临着极大的挑战，有很多空白需要我们去填补，有更多未知领域等待着我们去探索。

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